一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，属于免疫学检测技术领域。本发明专利技术的技术方案是把式I结构的乙酰氨基葡萄糖与含‑COOH的载体物质通过脱水缩合反应，形成乙酰氨基葡萄糖偶联物。通过上述方法获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物可用于制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体，以及应用于免疫方法检测样品中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体。用本发明专利技术获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂，具有灵敏度高、特异性强、性能稳定等优点。

Preparation and application of an acetylglucosamine conjugate

The invention discloses a type I acetylglucosamine coupling compound and its application, which belongs to the field of immunological detection technology. The technical scheme of the present invention is to form an acetylglucosamine conjugate by dehydration and condensation reaction between acetylglucosamine with formula I structure and carrier material containing COOH. Acetylglucosamine conjugates obtained by the above methods can be used to prepare anti-acetylglucosamine antibodies and to detect anti-acetylglucosamine antibodies in samples by immunoassay. The anti-acetylglucosamine antibody detection reagent prepared by the acetylglucosamine conjugate obtained by the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity and stable performance.

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法及应用
本专利技术涉及一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，具体涉及乙酰氨基葡萄糖偶联物结构、制备方法，以及在制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂中的应用。属于免疫学

技术介绍
微生物细胞壁多糖在一些自体免疫性疾病的发生发展过程中起重要作用，这些自体免疫性疾病患者的血清中能检测到多种多糖的抗体。其中抗酿酒酵母细胞壁多糖IgA(anti-SaccharomycescerevisiaeimmunoglobulinA，ASCA-IgA)和抗酿酒酵母细胞壁多糖IgG(anti-SaccharomycescerevisiaeimmunoglobulinG，ASCA-IgG)是被临床广泛认可的克罗恩病的特异性指标。乙酰氨基葡萄糖是酿酒酵母细胞壁多糖的组分之一，不排除克罗恩病特异性指标ASCA中含有乙酰氨基葡萄糖抗原表位。迄今为止，在临床应用的酿酒酵母细胞壁多糖抗原是天然结构的糖蛋白，其中包含了三种不同糖苷键连接的甘露多糖，以及与乙酰氨基葡萄糖以beta-1，4糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖。由于ASCA检测试剂的各厂家原料来源不同，抗原表位的暴露程度不同，质控难度大，检测结果差异显著。为此，以色列科学家专利技术了用乙酰氨基葡萄糖作为抗原的乙酰氨基葡萄糖二糖anti-chitobiosidecarbohydrateIgAantibodies(ACCA)以及乙酰氨基葡萄糖多聚糖为抗原的anti-chitinIgAantibodies(anti-C)检测试剂。对比文献US2008/0085838A1公布了乙酰氨基葡萄糖寡糖基与固相载体偶联的方法，其是通过活化1号位-OH与固相载体偶联，这种方法的缺陷是无法保证只跟1号位-OH偶联，如果跟其他位的-OH偶联，会影响与抗体结合，对试剂的稳定性造成显著影响，前期研究发现商品化的ACCA。而且1号位的偶联步骤繁琐、效率低下，最终试剂稳定性差。此外，目前ACCA和anti-C的检测主要是ELISA，该方法检测时间长，不适合门诊快速检测，临床上需要更便捷、快速的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物，及其在检测抗乙酰氨基葡萄糖抗体中的应用。本专利技术的第一方面，提供一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物的结构，其中一个糖基的2号位-NH2上通过肽键连接载体物质。所述乙酰氨基葡萄糖偶联物比对比文献公布的在1号位偶联具有操作简单、性能稳定、特异性高、不破坏抗原表位等优点。本专利技术的第二方面，提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法，包括以下步骤：1)与生物素反应①取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，室温磁力搅拌反应，离心收集上清液；②取式I乙酰氨基葡萄糖溶于磷酸缓冲液中；③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，搅拌反应；④缓冲液透析，得到偶联物。2)与蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽反应取蛋白质、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和式I乙酰氨基葡萄糖溶于DMF中，搅拌反应；缓冲液透析，得到偶联物。一种优选方案，式I中的R为NH2，此NH2基团跟生物素反应被生物素化，然后与固相载体上的链亲和素反应，或先跟亲和素形成复合物再包被到固相载体上。固相载体包括但不限于树脂微球、乳胶微球、磁微粒、微孔板、硝酸纤维素膜。本专利技术的第三方面，公开前述的乙酰氨基葡萄糖偶联物在检测或测定样品中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的应用。本专利技术提供的抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测中的应用，是基于免疫学反应的对样本中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的测定方法，包括如下步骤：(1)将前述的乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在固相载体上；(2)待检测样本作用于固相载体，使样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体与固相载体上的乙酰氨基葡萄糖抗原结合；(3)通过标记物测定样品中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的含量。乙酰氨基葡萄糖偶联物可通过目前任何一种免疫学检测方法检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体，比如ELISA、板式化学发光、管式化学发光、免疫层析、免疫渗滤等等。在实施例3中，为了比较本专利技术乙酰氨基葡萄糖偶联物与对比文献ACCA用于克罗恩的检测效果，把乙酰氨基葡萄糖偶联物生物素化，包被在预包被有亲和素的微孔板，用于ELISA检测，验证了本专利技术乙酰氨基葡萄糖偶联物具有更高的灵敏度。实施例4所示是一种抗乙酰氨基葡萄糖抗体的管式化学发光方法，所述方法是通过把乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在磁微粒上，与样本作用，捕获样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体，然后用标记抗人IgG或/和IgA检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体含量。为了进一步提高检测灵敏度，实施例中的乙酰氨基葡萄糖偶联物经过生物素-链亲和素放大系统包被在磁微粒上。该检测方法具有灵敏度高、检测时间短、全自动检测等优点。实施例5和6是提供抗乙酰氨基葡萄糖抗体的免疫层析方法，其中实施例5是荧光免疫层析定量检测，实施例6是胶体金定性检测。所述荧光免疫层析定量检测方法是把乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在荧光微球和检测线T线上，形成双抗原夹心法检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体含量。为了提高检测灵敏度，优选地，乙酰氨基葡萄糖偶联物经过生物素化通过链亲和素包被在荧光微球上。该检测方法具有快速、检测时间短、仪器成本小等优点。与现有技术相比，本专利技术提供的乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用在克罗恩病等自体免疫性疾病诊断方面，具有灵敏度高、性能稳定、操作简单等优点。附图说明图1式I乙酰氨基葡萄糖结构示意图图2管式化学发光定量检测标准曲线图3管式化学发光试剂检测的特异性与灵敏度图4荧光免疫层析试剂标准曲线具体实施方式本专利技术所用的式I乙酰氨基葡萄糖原料是市售的脱酰胺度为20％左右的壳聚糖。对照试剂盒ACCA购自以色列Glycominds公司。生物素购自Sigma。亲和素购自盘古基因。其他试剂购自国药试剂。下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。实施例1式I乙酰氨基葡萄糖偶联物制备1、式I乙酰氨基葡萄糖生物素偶联物的制备①取0.01mM生物素、0.01mM二环己基碳二亚胺(DCC)和0.01mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于2mlDMF中，室温磁力搅拌反应16h后，3000rpm离心5min，收集上清液；②取20mg式I乙酰氨基葡萄糖，溶于1ml磷酸缓冲液中；③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，2-8℃搅拌反应16h；④用磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到生物素化式I乙酰氨基葡萄糖。2、式I乙酰氨基葡萄糖与BSA/HSA/KLH偶联取式I乙酰氨基葡萄糖、DCC和NHS溶于DMF中，室温磁力搅拌反应16h后，离心收集上清液；将上清液逐滴加入到BSA、HSA或KLH溶液中，2-8℃搅拌反应16h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到式I乙酰氨基葡萄糖与载体蛋白BSA/HSA/KLH偶联物，即式I乙酰氨基葡萄糖-BSA、式I乙酰氨基葡萄糖-HSA和式I乙酰氨基葡萄糖-KLH。3、乙酰氨基葡萄糖与多肽偶联取20mg多肽，0.01mM1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和20mg式I乙酰氨基葡萄糖溶于2mlDMF中，2-8℃搅拌反应16h；用磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到偶联物。实施例2制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体1、动物免疫用实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物，其特征在于，糖基间以beta‑1，4糖苷键连接，其中乙酰氨基葡萄糖数量n为大于1或等于1的整数，R为载体物质，与其中一个糖基的2号位NH2以肽键连接。

【技术特征摘要】
1.一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物，其特征在于，糖基间以beta-1，4糖苷键连接，其中乙酰氨基葡萄糖数量n为大于1或等于1的整数，R为载体物质，与其中一个糖基的2号位NH2以肽键连接。2.一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法，其特征在于，式I中的游离-NH2与载体物质中的-COOH的脱水缩合反应形成偶联物，包括以下步骤：1)与生物素反应①取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，搅拌反应，离心收集上清液；②取式I乙酰氨基葡萄糖溶于缓冲液中；③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，搅拌反应；④缓冲液透析，得到偶联物。2)与蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽反应取蛋白质或多肽、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和式I乙酰氨基葡萄糖溶于DMF中，搅拌反应；缓冲液透析，得到偶联物。3.权利要求2所述的载体物质，为含有-COOH的有机物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振军，陈菲，
申请(专利权)人：苏州和锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32