一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于液相色谱‑质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法。基于多种类型基质提取制作单独或混合样本，利用超高效液相色谱‑高分辨质谱数据依赖采集模式自动采集合并各样本脂质代谢物的二级质谱，采用定性分析软件提取脂质保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，得到特征离子对；将不同类型样本得到的特征离子对信息加和，进一步根据脂质数据库、脂质结构特征以及色谱保留规律对脂质离子对进行扩充，得到最终的脂质离子对库。利用UPLC‑QQQ‑MS通过动态多反应监测模式对脂质离子对进行扫描。与传统非靶向脂质组学分析方法相比，本发明专利技术具有更好的重复性、脂质覆盖度。

A High Cover Lipid Histochemistry Analysis Method Based on Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

The invention discloses a method for high coverage lipid histology analysis based on liquid chromatography and mass spectrometry. The second-order mass spectra of lipid metabolites were collected and merged automatically by using data-dependent acquisition mode of ultra-high performance liquid chromatography and high resolution mass spectrometry. The information of lipid retention time, mother ions and their daughter ions were extracted by qualitative analysis software. The characteristic daughter ions corresponding to mother ions were screened according to the structural characteristics of lipid mass spectrometry. To the characteristic ion pair, the information of characteristic ion pair obtained from different types of samples is added, and then the lipid ion pair is expanded according to the lipid database, lipid structure characteristics and chromatographic retention rules to obtain the final lipid ion pair library. Lipid ion pairs were scanned by UPLC QQQ MS through dynamic multi-reaction monitoring mode. Compared with the traditional non-targeting lipid histology analysis method, the present invention has better repeatability and lipid coverage.

【技术实现步骤摘要】
一种基于液相色谱-质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法
本专利技术涉及分析化学、生物化学和医学领域，是一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱联用的采用动态多反应监测模式进行高覆盖脂质组学分析的方法。
技术介绍
脂质是细胞膜的重要组成部分，在细胞的信号传导、物质运输、能量储存等方面发挥重要的作用。脂质代谢异常与众多疾病如肥胖、高血压、糖尿病、心血管疾病、帕金森、癌症等的发生发展密切相关。脂质组成繁多，结构复杂，人体内脂质高低含量的差别高达6～7个数量级。因此，建立可靠、稳定、高覆盖、高灵敏的脂质代谢物分析方法对研究与脂代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。脂质组学技术致力于通过分析复杂生物样本中尽可能多的脂质代谢物及其受到外界刺激/扰动后所发生的变化来研究与脂质代谢表型相关的生物现象及其功能。近年来，已被广泛应用于相关疾病的研究，用于发现与疾病预防及诊断相关的脂质标记物，为疾病的发生、发展机理及药物疗效的评价提高理论依据。常用的脂质组学分析方法主要有基于质谱技术的直接进样法即“鸟枪法”和基于色谱－质谱的联用技术。“鸟枪法”，分析通量高，但离子抑制问题明显，不利于低丰度及同分异构脂质的分析检测。基于色谱－质谱联用的脂质组学分析技术由于具有质谱检测前的色谱预分离过程，可大大减少离子抑制，提高检测灵敏度，改善痕量脂质及同分异构脂质代谢物的分离检测。目前脂质组学的分析策略主要分为两种：非靶向分析和靶向分析。非靶向脂质组学分析是基于质谱技术的一种常用的脂质分析方法，只需将样本按照一定的步骤进行预处理，利用质谱的全扫描模式及数据依赖模式的二级离子扫描对待测样品分析，再利用软件对采集的全扫描谱图进行峰匹配，得到包含质荷比(m/z)，保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表，然后根据二级谱图及准确质量数对m/z进行归属；也可利用商业化的脂质定性软件，先对采集的二级谱图进行定性，再根据定性结果通过脂质定量软件对全扫描谱图进行靶向提取，得到脂质代谢物、保留时间(色谱-质谱联用)及强度等信息的峰表。通过多变量或单变量统计分析找出差异脂质代谢物，并进行进一步的生物学解释。非靶向脂质组学分析常用的质谱是高分辨的飞行时间质谱、四级杆-飞行时间串联质谱、四级杆-静电轨道阱串联质谱以及傅里叶变换-离子回旋共振质谱等，具有较高的质量准确度，利于脂质结构鉴定。但非靶向方法存在一定的局限性：如由于同时进行很宽范围的扫描，导致同时检测的离子数过多，使得质谱的线性响应较差，低丰度脂质难以检测，定量准确性也会受到影响；另外后续数据处理繁琐，峰匹配过程易受峰匹配参数的影响，会引入误差，由于匹配算法的局限，往往会得到错误的结果，影响数据的准确性，使得不同批次的数据难以重复。尽管商业化脂质定性、定量软件可利用脂质的一级、二级信息，直接给出脂质的定性定量结果，一定程度上提高了数据的准确性，但脂质定性软件高度依赖二级谱图，只能对有二级碎裂的脂质进行定性，导致多数丰度较低、没有二级碎裂的脂质信息会被掩盖。靶向脂质组学分析是基于质谱的另一种常见的脂质分析策略。通常采用用三重四级杆，通过多反应监测模式进行检测。三重四级杆多反应监测时，第一个四级杆选择脂质的特征母离子，第二个四级杆相当于碰撞池，将选定的母离子在一定电压下碎裂，第三个四级杆则选择待测脂质的特征子离子。靶向脂质组学分析，线性范围宽，可以最大程度满足样品中脂质的检测；选择性高，基质干扰小，灵敏度高，有利于痕量物质的检测；重复性好，数据质量高，不同批次间具有可比性，适合大规模样品分析；另外，由于离子对是预设的，无需峰匹配。但靶向脂质组学分析针对的是具有重要生物功能的某一类脂质代谢物或特定通路上的关键脂质代谢物，检测的脂质数目有限，难以满足脂质组学中检测尽可能多的脂质代谢物的需求。为了克服非靶向脂质组学和靶向脂质组学分析中的不足，本专利技术发展了一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱的高覆盖脂质组学分析方法。为了覆盖尽可能多的脂质，选择不同类型样品基质，利用超高效液相色谱-高分辨质谱进行非靶向数据依赖的自动二级质谱分析，获得脂质的保留时间、母离子及子离子信息。同时，结合脂质数据库和脂质的结构特征，对脂质离子对进行扩充，并根据实测脂质的保留时间和保留规律，对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与样品中获取的脂质特征离子对合并，建立高覆盖的脂质特征离子对库，以适应不同基质来源的样品如细胞、组织或血清/血浆的分析。后续分析可直接使用该特征离子对库，无需重复离子对的获取过程。根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，构建1个或几个超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法。实际待测的所有生物样本，首先采用质量控制样本，利用构建的1个或几个超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法获得实测样本中的有效脂质特征离子对，再对单个的待测生物样本，利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式对有效脂质特征离子对进行扫描分析。
技术实现思路
本专利技术针对非靶向和靶向脂质组学分析策略的不足，首先建立高覆盖的脂质特征离子对库。其次，提供了一种基于超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测(UHPLC/QQQ-MS-DMRM)的高覆盖脂质组学分析新方法。相较于传统的非靶向脂质组学分析，重复性好，线性范围宽，检测能力强，无需峰匹配，数据质量好等优点。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1)选择不同类型的样品基质，包括但不限于人或动物的组织、细胞、血浆/血清或植物的组织、细胞中的一种或多种；对样本进行脂质提取，其提取体系可以是氯仿-甲醇-水体系或甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，得到可供色谱/质谱分析的进样溶液(即脂质提取液冻干物的复溶液)；提取剂中加入8个外源代谢物PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1作为内标，用于色谱保留时间校正；单独或混合样本是指将各类型样品的进样溶液单独或等体积混合。2)利用超高效液相色谱/组合四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集合并各样本所含脂质代谢物的二级质谱。3)利用定性软件，如ThermoXcaliburQualBrowser和LipidSearch提取各样本所测得脂质代谢物的保留时间、校正保留时间、母离子、子离子信息；根据脂质的质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，进而构成特征离子对；将各样本中得到的特征离子对加和，这里所称的加和是指在任一样本中出现一次的特征离子对都作为一个最终的特征离子对，而在多个样本中均出现的离子对仅作为一个特征离子对。4)根据脂质数据库LipidMaps及脂质质谱结构特征，扩充脂质特征离子对；这里的扩充是指在实际样本中检测出的脂质基础上，进一步增加每类脂质的数目，而不涉及脂质类别的增加；基于实测脂质的保留时间及色谱保留规律，对扩充脂质离子对进行保留时间预测，将其与实测样本中的特征离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；这里的色谱保留规律是指脂质的保留时间与碳数、保留时间与碳-碳双键数间的对应关系。5)采用不同类别脂质标样混合物，优化每类脂质特征离子对的质谱去簇电压和碰撞能等质谱条件，作为该类脂质的最佳质谱条件；将脂质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于液相色谱－质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法，其特征在于：①利用超高效液相色谱/组合型四级杆‑轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集由多种类型样品提取制作的单独或混合样本中所含脂质代谢物的二级质谱；②采用定性分析软件从二级质谱数据中提取所测得脂质的保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，构成特征离子对；将不同类型样本中得到的特征离子对信息加和；根据脂质数据库及脂质结构特征，对脂质离子对扩充，利用色谱保留规律对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与实测样本中的离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；③根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，对实际待测的所有生物样本的进行高覆盖脂质组学分析分析；首先利用构建的超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法在正、负离子模式下对单个样本或2个以上样本混合的质量控制样本(样本量大于1时)进行单针或多针采集，获得该样本中的有效脂质特征离子对，即与脂质离子对库比对中重合的离子对；④利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测在正、负离子模式下对单个待测生物样本仅对有效脂质特征离子进行扫描，获得相应的谱图，再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品中脂质代谢物及其定量信息。...

【技术特征摘要】
1.一种基于液相色谱－质谱联用的高覆盖脂质组学分析方法，其特征在于：①利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集由多种类型样品提取制作的单独或混合样本中所含脂质代谢物的二级质谱；②采用定性分析软件从二级质谱数据中提取所测得脂质的保留时间、母离子及其子离子信息；根据脂质质谱结构特征筛选母离子对应的特征子离子，构成特征离子对；将不同类型样本中得到的特征离子对信息加和；根据脂质数据库及脂质结构特征，对脂质离子对扩充，利用色谱保留规律对扩充的脂质离子对进行保留时间预测，并将其与实测样本中的离子对合并，得到总的脂质特征离子对库；③根据脂质特征离子对库的保留时间和特征离子对信息，对实际待测的所有生物样本的进行高覆盖脂质组学分析分析；首先利用构建的超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测模式方法在正、负离子模式下对单个样本或2个以上样本混合的质量控制样本(样本量大于1时)进行单针或多针采集，获得该样本中的有效脂质特征离子对，即与脂质离子对库比对中重合的离子对；④利用超高效液相色谱/三重四级杆质谱动态多反应监测在正、负离子模式下对单个待测生物样本仅对有效脂质特征离子进行扫描，获得相应的谱图，再通过定量分析软件进行峰面积积分，得到待测样品中脂质代谢物及其定量信息。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：单独或混合样本的制备及其所含脂质代谢物二级质谱的获取步骤如下，1)选择不同类型的样品基质，包括但不限于人或动物的组织、细胞、血浆或血清、或植物的组织或细胞中的一种或多种；对样本进行脂质提取，其提取体系可以是氯仿-甲醇-水体系或甲基叔丁基醚-甲醇-水体系，得到可供色谱/质谱分析的进样溶液(即脂质提取液冻干物的复溶液)；提取剂中加入8个外源代谢物PC38:0，LPC19:0，TG45:0，PE34:0/PE30:0，FFA16:0-d3，FFA18:0-d3，Cer35:1，SM30:1作为内标，用于色谱保留时间校正；单独或混合样本是指将各类型样品的进样溶液单独或等体积混合；2)利用超高效液相色谱/组合型四级杆-轨道阱质谱的数据依赖采集模式自动采集合并各样本所含脂质代谢物的二级质谱。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：脂质特征离子对库的构建步骤如下，1)利用定性软件，如Ther...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，轩秋慧，胡春秀，路鑫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21