The invention discloses a large-scale qualitative method of acyl carnitine based on mixed biological samples. For different types of biological samples (blood, urine, tissue), acetonitrile/water was used as extractant, whirlpool (blood, urine)/bead grinding (tissue) was used as extraction method, centrifugal supernatant was taken for vacuum freeze-drying, acetonitrile/water was dissolved and mixed, and ultra-high performance liquid chromatography combined quadrupole ion trap mass spectrometry was used for analysis. Based on the characteristic ion and neutral loss obtained from the standard sample, the parent ion was screened out and detected by parallel reaction monitoring mode. The method of the invention has rich metabolic species obtained by detecting samples, greatly increasing the number of acyl carnitine that can be qualitatively determined by one analysis. The method of the invention has the advantages of simple pretreatment, reliable qualitative characterization and sufficient acquisition of acyl carnitine structural information.
【技术实现步骤摘要】
一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法
本专利技术涉及分析化学领域和疾病代谢组学领域,是一种基于混合生物样本采用平行反应监测模式定性和色谱保留时间预测的酰基肉碱大规模定性方法。
技术介绍
肉碱的化学结构是L-3-羟基-4-三甲基氨基丁酸。在生物体内,长链脂肪酸在线粒体膜上的转移酶的作用下,从酰基辅酶A转移到肉碱生成酰基肉碱。酰基肉碱能调节脂肪酸代谢,参与支链氨基酸代谢,是一类重要的内源代谢物,与先天性遗传代谢病,糖尿病等多种疾病相关。酰基肉碱的代谢轮廓分析对相关疾病的筛查诊断,机理研究有重要意义。然而目前从生物样本中定性出的酰基肉碱种类却非常有限。因此,开展大规模的酰基肉碱定性方法是十分必要的。目前已有的酰基肉碱定性方法,为了提高酰基肉碱的覆盖度,采用了SPE富集,衍生化,二维色谱,细内径色谱柱等手段。而这些方法存在前处理繁琐,流路复杂,分析时间长等缺点。已有的定性手段分为标样定性和单一离子对结合保留时间定性两种,前者大大限制了鉴定出的酰基肉碱数目,后者定性的准确性较差。综上,在不受标样限制的前提下,提高定性可靠性是目前的难点问题。本专利技术中采用了混合健康人血样、尿样,小鼠组织的样本,大大提高了样本中酰基肉碱的覆盖度,且前处理简单;采用了高分辨质谱平行反应监测模式对样品进行分析,一方面提高了灵敏度且不增加分析时间,另一方面得到的二级碎片信息全面且均为精确质量数,大大提高了定性的准确性,也摆脱了标样不足的限制。至今尚无将本专利技术所述方法应用于代谢组学中酰基肉碱大规模定性的报道。
技术实现思路
本专利技术为了实现酰基肉碱大规模定性,建立了基于混合生物样本 ...
【技术保护点】
1.一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法,其特征在于:(1)分别将血样、尿样采用乙腈作为提取剂,以涡旋方式提取;组织样采用乙腈/水作为提取剂,以珠打研磨方式提取;分别离心取上清液进行真空冷冻干燥,得冻干样本;(2)血、尿、组织冻干样本分别用乙腈/水复溶,混合;(3)采用超高效液相色谱‑组合型四极杆离子阱质谱联用仪分层采集信息,即第一步数据依赖监测模式采集二级质谱信息,筛选对应的酰基肉碱母离子;第二步扩展酰基肉碱母离子种类后,用平行反应监测模式采集二级质谱信息,确认酰基肉碱结构;(4)根据二级质谱信息,实际色谱保留时间和预测油水分配系数ClogP的对应关系,对生物样本中的酰基肉碱进行检测和结构鉴定;(5)预测样品中未检测到的酰基肉碱的保留时间,进一步扩展酰基肉碱种类。
【技术特征摘要】
1.一种基于混合生物样本的酰基肉碱大规模定性方法,其特征在于:(1)分别将血样、尿样采用乙腈作为提取剂,以涡旋方式提取;组织样采用乙腈/水作为提取剂,以珠打研磨方式提取;分别离心取上清液进行真空冷冻干燥,得冻干样本;(2)血、尿、组织冻干样本分别用乙腈/水复溶,混合;(3)采用超高效液相色谱-组合型四极杆离子阱质谱联用仪分层采集信息,即第一步数据依赖监测模式采集二级质谱信息,筛选对应的酰基肉碱母离子;第二步扩展酰基肉碱母离子种类后,用平行反应监测模式采集二级质谱信息,确认酰基肉碱结构;(4)根据二级质谱信息,实际色谱保留时间和预测油水分配系数ClogP的对应关系,对生物样本中的酰基肉碱进行检测和结构鉴定;(5)预测样品中未检测到的酰基肉碱的保留时间,进一步扩展酰基肉碱种类。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中吸取50-100μL正常人的混合血样/尿样置于1.5mL离心管中;加入200-400μL乙腈,涡旋30-60s;称取小鼠的肝组织5-10mg±0.5mg置于2mL离心管中,依次加入氧化锆小球,500-1000μL体积比为5:1-3:1的乙腈/水,采用混合研磨仪在20-30Hz的条件下研磨提取1-2min,重复两次;将上述的血,尿,组织提取后的样品放入离心机中,在3-5℃,13000-15000rpm条件下离心10-15min;取离心之后的上清液,其中血样225-450μL,尿样230-460μL,组织210-430μL,置于1.5mL离心管中;放入真空冷冻干燥机中,在3-5℃下冻干3-4h,冻干样本封好备用。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(2)中冻干后的样品分别加入50μL体积比为1:2-1:4的乙腈/水;其中含9种氘代内标,乙酰肉碱-d3,丁酰肉碱-d3,己酰肉碱-d3,辛酰肉碱-d3,癸酰肉碱-d3,十二酰基肉碱-d3,十六酰基肉碱-d3,3-羟基异戊酰肉碱-d3,3-羟基-9-十六碳烯酰基肉碱-d3,内标物的浓度均为0.05-0.15μg/ml;涡旋至完全溶解后,置于离心机,在3-5℃,13000-15000rpm条件下离心10-15min,取上清液,涡旋混合待分析。4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)采用超高效液相色谱-组合型四极杆离子阱质谱联用仪进行数据依赖监测-平行反应监测递进式的信息采集方案;液相色谱-质谱操作条件如下:(1)液相色谱条件:WatersBEHC18色谱柱2.1mm×100mm,1.7μm;柱温为40℃;流动相:A相为0.1%甲...
【专利技术属性】
技术研发人员:许国旺,于迪,周丽娜,
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所,
类型:发明
国别省市:辽宁,21
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