检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及所用引物技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种基于荧光定量PCR检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及应用。本发明专利技术公开了检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法所用的特异性引物，包括通用正向引物F4、针对链格孢属的反向引物Cla‑R、针对枝孢属的反向引物Alt‑R，还包括针对内参基因的正向引物GAPDH‑F、反向引物GAPDH‑R。本发明专利技术还同时公开了利用上述特异性引物进行的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，本发明专利技术能够在短时间内完成病原真菌的动态变化检测。

Detection of dynamic changes of pathogenic fungi of Dendrobium candidum black spot and the primers used

The invention belongs to the field of genetic engineering, and relates to a method and application for detecting dynamic changes of pathogenic fungi of Dendrobium candidum black spot disease based on fluorescence quantitative PCR. The invention discloses specific primers used for detecting the dynamic changes of pathogenic fungi of Dendrobium candidum black spot, including general forward primer F4, reverse primer Cla R for Alternaria, reverse primer Alt R for Cladosporium, and forward primer GAPDH F and reverse primer GAPDH R for internal reference gene. The invention also discloses a method for detecting the dynamic changes of pathogenic fungi of Dendrobium candidum black spot by using the above specific primers. The method can complete the dynamic changes detection of pathogenic fungi in a short time.

【技术实现步骤摘要】
检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及所用引物
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于荧光定量PCR检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及应用。
技术介绍
铁皮石斛属于兰科植物，是南亚和东南亚最受欢迎的附生多年生草本植物之一。在中国，它主要分布在安徽，浙江，福建，广西，四川和云南省。铁皮石斛是一种重要的中药。野生铁皮石斛主要附生或岩生在海拔较高的古树和峭壁上，与微生物协同共生是其适应特殊生境的自然选择。因此目前对于铁皮石斛中的内生菌的相关研究也越来越受到重视。而在铁皮石斛人工培育过程中，常用的杀菌剂及杀菌方法只能对于石斛表面病原菌有消杀作用，而对于其内生菌的作用极其有限。这就导致了石斛移植苗往往处于带菌状态。铁皮石斛黑斑病是铁皮石斛移植苗中常见的真菌病害之一，最早报道是发生在浙江义乌。目前全国各石斛产区均有黑斑病发生，以浙、滇、桂、贵等省份发病较为严重。在云南西双版纳、文山、德宏、普饵等地的石斛基地的铁皮石斛、金钗石斛和齿瓣石斛常有黑斑病发生，发病率在30％左右。而浙江地区铁皮石斛黑斑病发病严重，每丛铁皮石斛中的病株数高达50％左右，每株上的病叶数同样高达50％，发病率最低都在30％以上，病株叶片后期枯黄脱落(图1)，影响铁皮石斛产量及品质，严重制约石斛产业的发展。以往有报道表明，链格孢属真菌和枝孢属真菌为诱发铁皮石斛黑斑病的病原真菌。实时定量PCR技术作为一种高效的检测手段，已被广泛用于真菌多样性的检测。其主要扩增的是真菌核糖体转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)部分序列。该区域作为非编码区，具有相对进化速度快，选择压力较小等特点，具有很高的可变性，因此被广泛用于真菌的分类和鉴定中。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种一种基于荧光定量PCR检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法所用的特异性引物：通用正向引物F4：5'-CGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-3'；针对链格孢属的反向引物Cla-R：5'-GCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGA-3'；针对枝孢属的反向引物Alt-R：5'-AGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAA-3'。本专利技术还同时提供了利用上述特异性引物进行的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，包括以下步骤：1)、设定引物：包括通用正向引物F4、针对链格孢属的反向引物Cla-R、针对枝孢属的反向引物Alt-R；还包括针对内参基因的正向引物GAPDH-F、反向引物GAPDH-R；GAPDH-F：5'-CAAGGACTGGAGAGGTGGAAGA-3'，GAPDH-R：5'-CAAGGACTGGAGAGGTGGAAGA-3'；2)、配置反应体系(20μL)：10μL2*SuperRealPreMix，0.6μL正向引物(10μM)以及0.6μL反向引物(10μM)，80ng待测样品的基因组，0.4μLROXreferencedye；RNase-freeddH2O加至总体积20μL；3)、qPCR反应程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，32sec，循环40次；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，30sec；60℃，15sec；4)、判定：以表现有黑斑病症状的发病铁皮石斛作为样品、以健康铁皮石斛作为对照(所述健康铁皮石斛是植株叶片表面没有黑斑病症状)；当以植物GAPDH作为内参基因时，正向引物选用GAPDH-F，反向引物选用GAPDH-R；从而获得样品的CT样品内参和对照的CT对照内参；当为针对铁皮石斛中链格孢属的检测时，正向引物选用正向引物F4，反向引物选用Cla-R；从而分别样品的CT(链)样品以及对照的CT(链)对照；当为针对枝孢属的检测时，正向引物选用正向引物F4，反向引物选用Alt-R；从而分别样品的CT(枝)样品以及对照的CT(枝)对照；ΔCT(链)样品＝CT(链)样品-CT样品内参，ΔCT(链)对照＝CT(链)对照-CT对照内参，ΔΔCT(链)＝ΔCT(链)样品-ΔCT(链)对照，依据ΔΔCT(链)的值，判断样品中链格孢属真菌相对生物量变化情况；ΔCT(枝)样品＝CT(枝)样品-CT样品内参，ΔCT(枝)对照＝CT(枝)对照-CT对照内参，ΔΔCT(枝)＝ΔCT(枝)样品-ΔCT(枝)对照，依据ΔΔCT(枝)的值，判断样品中枝孢属真菌相对生物量变化情况。作为本专利技术的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法的改进，步骤4)中：当ΔΔCT(链)＜0时，判定样品中链格孢属真菌相对生物量增加；当ΔΔCT(枝)＜0时，判定样品中枝孢属真菌相对生物量增加。相对生物量＝2-ΔΔCT。说明：作为样品的发病铁皮石斛、作为对照的健康铁皮石斛，这2者必须是同一产地的。本专利技术的qPCR反应结果，当溶解曲线为双峰时，说明反应可能存在污染，需要重新进行。当溶解曲线为单一峰时，继续进行如下操作：当15≤CT值≤35，判定待测样品存在链格孢属/枝孢属；当CT值＜15时，判定为需要重新进行实验(即，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值，数据不采纳，需稀释模板重新实验)；当CT值＞35，判定为不存在链格孢属/枝孢属。本专利技术是一种基于荧光定量PCR检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，用于高效便捷检测引起铁皮石斛黑斑病的病原真菌相对生物量的变化。本专利技术针对铁皮石斛黑斑病病原(链格孢属和枝孢属)真菌的ITS序列，分别设计特异性引物，从而实现对这两类病原菌的高效快速鉴定。本专利技术基于荧光实时定量qPCR技术，对于样品中的链格孢属和枝孢属的病原真菌相对生物量(即，相对于植物内参基因GAPDH)进行检测。其中，F4和Cla-R这对引物特异性地检测样品中枝孢属病原真菌的积累量；使用F4和Alt-R这对引物特异性地检测样品中链格孢属病原真菌的相对生物量。本专利技术的专利技术过程如下：1)、针对铁皮石斛黑斑病叶的宏基因组数据，鉴定到了两株病原真菌GXDF3和GXDF24，分别属于链格孢属和枝孢属真菌。以铁皮石斛黑斑病病叶为材料，对其中的微生物进行宏基因组测序；分别得到了能够引起铁皮石斛黑斑病的病原真菌GXDF3和GXDF24的部分ITS序列，分别如下：GXDF3-ITS：TCTATGAGCGGGCTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法所用的特异性引物，其特征是：通用正向引物F4：5'‑CGATGAAGAACGCAGCGAAATGC‑3'；针对链格孢属的反向引物Cla‑R：5'‑GCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGA‑3'；针对枝孢属的反向引物Alt‑R：5'‑AGCTTGAGGG TACAAATGACGCTCGAA‑3'。

【技术特征摘要】
1.检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法所用的特异性引物，其特征是：通用正向引物F4：5'-CGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-3'；针对链格孢属的反向引物Cla-R：5'-GCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGA-3'；针对枝孢属的反向引物Alt-R：5'-AGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAA-3'。2.利用如权利要求1所述的特异性引物进行的检测铁皮石斛黑斑病病原真菌动态变化的方法，其特征是包括以下步骤：1)、设定引物：包括通用正向引物F4、针对链格孢属的反向引物Cla-R、针对枝孢属的反向引物Alt-R；还包括针对内参基因的正向引物GAPDH-F、反向引物GAPDH-R；GAPDH-F：5'-CAAGGACTGGAGAGGTGGAAGA-3'，GAPDH-R：5'-CAAGGACTGGAGAGGTGGAAGA-3'；2)、配置反应体系：10μL2*SuperRealPreMix，0.6μL正向引物以及0.6μL反向引物，80ng待测样品的基因组，0.4μLROXreferencedye；RNase-freeddH2O加至总体积20μL；3)、qPCR反应程序为：95℃，15min；95℃，10sec；60℃，32sec，循环40次；95℃，15sec；60℃，1min；95℃，30sec；60℃，15sec；4)、判定：以表现有黑斑病症...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾周杭，韩潇莹，胡秀芳，戴一弘，赵飞燕，臧凯，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33