菵草CYP704B1基因的应用制造技术

本发明专利技术提供菵草CYP704B1基因的应用。本发明专利技术还提供用于检测菵草CYP704B1基因表达量的荧光定量PCR引物(SEQ ID NO:2‑3)以及基于该引物建立的检测菵草CYP704B1基因表达量的方法，以此判断菵草对磺酰脲类(特别是甲基二磺隆)除草剂的抗性。所述方法具有简便、灵敏度高、特异性强的优点，在菵草对甲基二磺隆非靶标抗性的检测和研究中具有重要的应用前景。本发明专利技术首次揭示了菵草CYP704B1基因与磺酰脲类除草剂抗性之间的关系，可通过检测CYP704B1基因的表达量来鉴定菵草对除草剂是否产生代谢抗性，对及时发现抗性并指导农田科学用药及缓解抗药性进一步蔓延具有指导意义。

Application of CYP704B1 Gene in Potamogeton crispus

The invention provides the application of the CYP704B1 gene of Potamogeton crispus. The invention also provides a fluorescent quantitative PCR primer (SEQ ID NO: 2 3) for detecting the expression of CYP704B1 gene of Potamogeton Crispus and a method for detecting the expression of CYP704B1 gene of Potamogeton crispus based on the primer, so as to judge the resistance of Potamogeton crispus to sulfonylureas (especially methyl disulfuron) herbicides. The method has the advantages of simplicity, high sensitivity and specificity, and has important application prospects in the detection and research of non-target resistance of tobacco to methyl disulfuron. The present invention discloses for the first time the relationship between CYP704B1 gene and sulfonylurea herbicide resistance. The metabolic resistance of tobacco to herbicide can be identified by detecting the expression level of CYP704B1 gene, which is of guiding significance for timely discovery of resistance and guiding scientific drug use in farmland and alleviating further spread of resistance.

【技术实现步骤摘要】
菵草CYP704B1基因的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及菵草CYP704B1基因的应用。
技术介绍
除草剂长期连续的不科学施用易导致杂草抗药性的产生，我国部分地区小麦和油菜田菵草已对除草剂产生了严重抗性，且随着非靶标抗性的产生，使菵草的治理更加困难。目前，已有研究表明，细胞色素P450通过脱烷基化作用、环甲基羟基化作用、芳环的羟基化作用、脱硫氧化作用和催化酯键断裂等方式能够将除草剂代谢为无毒物质，而P450家族中某些基因的表达量增加会使原本敏感的杂草种群对除草剂产生抗性(YasuorH,OsunaMD,OrtizA,etal.Mechanismofresistancetopenoxsulaminlatewatergrass[Echinochloaphyllopogon(Stapf)Koss.].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2009,57:3653–3660；YangQ,DengW,LiXF,etal.Target-siteandnon-target-sitebasedresistancetotheherbicidetribenuron-methylinflixweed(DescurainiasophiaL.).BMCGenomics,2016,17(1):551；ZhaoBC,FuD,YuY,etal.Non-target-siteresistancetoALS-inhibitingherbicidesinaSagittariatrifoliaL.population.PesticideBiochemistryPhysiology,2017,140:79-84；PanL,GaoHT,XiaWW.Establishingaherbicide-metabolizingenzymelibraryinBeckmanniasyzigachnetoidentifygenesassociatedwithmetabolicresistance.JournalofExperimentalBottany,2016,67:1745-1757)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供菵草CYP704B1基因的应用。本专利技术构思如下：由于代谢除草剂的相关基因在不同菵草材料中的表达存在差异，造成菵草材料之间抗性不同，要科学地治理抗药性菵草，首先需要研究其抗性机制。本专利技术提供的检测菵草CYP704B1基因的表达量的引物(即为荧光定量引物)，自身无发夹结构，不形成引物二聚体，特异扩增唯一鉴别片段，扩增产物长度为85bp。利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，快速判断在不同时期，不同材料间的菵草CYP704B1的表达量，进而确定菵草抗性情况，可用于科学治理抗药性菵草。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供菵草CYP704B1基因的以下任一应用：1)在鉴定不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性中的应用；2)作为不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性的标志物中的应用；3)在鉴定抗磺酰脲类除草剂的菵草材料中的应用。本专利技术中，所述菵草CYP704B1基因为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)与i)、ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术中，所述磺酰脲类除草剂包括但不限于甲基二磺隆。第二方面，本专利技术提供用于扩增菵草CYP704B1基因的特异性PCR引物(即用于检测菵草CYP704B1基因表达量的引物)，包括CYP704B1-F1和CYP704B1-R1，核苷酸序列分别如SEQIDNO:2和3所示。所述用于检测菵草CYP704B1基因表达量的引物CYP704B1-F1/R1，可通过如下方法获得：(1)利用菵草转录组测序得到CYP704B1的基因序列进行深入分析；(2)设计荧光定量PCR备选引物，用于后续筛选；(3)提取待检测菵草总RNA，反转录为cDNA；(4)以步骤(3)所得cDNA为模板，以步骤(2)设计的引物为引导进行实时荧光定量PCR扩增，筛选出溶解曲线符合要求的引物对；(5)以步骤(3)所得cDNA为模板，以步骤(4)筛选的引物为引导进行普通PCR扩增，对所得扩增产物进行测序，验证引物是否特异扩增目的基因CYP704B1，最终筛选出特异检测CYP704B1基因表达量的引物CYP704B1-F1/R1。步骤(2)中，利用Oligo7.0软件和Primer5.0软件设计荧光定量PCR引物，荧光定量PCR引物设计标准为：引物长度在20-25nt，扩增产物长度不超过300bp，退火温度大于60℃，单条引物之间退火温度差距在1℃之间，3ˊ端不宜为A，引物自身不形成发卡结构，不形成引物二聚体。SYBRGreenI染料与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确，而本专利技术最终筛选出的引物CYP704B1-F1/R1自身无发夹结构，不形成引物二聚体，仅能扩出唯一鉴别片段，因此其检测结果可信。第三方面，本专利技术提供含有上述引物的检测试剂或试剂盒。进一步地，所述试剂盒还包括与所述引物配合使用的荧光染料，如SYBRGreenI。第四方面，本专利技术提供一种检测菵草CYP704B1基因表达量的方法，所述方法包括：提取待测菵草总RNA，反转录为cDNA；然后，利用引物CYP704B1-F1和CYP704B1-R1，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；同时设置内参基因，计算CYP704B1基因的相对表达量。本专利技术中，所述内参基因选自UBQ、CAP及GADPH中的至少一个，用于扩增各内参基因的引物分别如下(SEQIDNO:4-9)：UBQ-F：5ˊ-CAAGAAGAAGACGTACACCAAG-3ˊUBQ-R:5ˊ-GACCTTGTAGAACTGGAGGAG-3ˊ；CAP-F:5ˊ-AAGCCCCAATCAAAATCAACACGAA-3ˊCAP-R:5ˊ-AAGAACACCAAGACCCCCTGC-3ˊ；GADPH-F：5ˊ-AGGTTATCAATGACAAGTTTGG-3ˊGADPH-R：5ˊ-ATCAACAGTCTTCTGGGTAGC-3ˊ。可选地，PCR反应体系和反应程序如下：PCR反应体系：2.5mMdNTP混合液2μL，10×PCRBuffer2.5μL，10μM上、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，cDNA1μL，用ddH2O补齐至25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。第五方面，本专利技术提供上述方法在鉴定不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性中的应用。其中，所述应用包括根据CYP704B1基因的相对表达量来鉴定不同菵草材料对磺酰脲类(特别是甲基二磺隆)除草剂的抗性。当CYP704B1基因的相对表达量为敏感材料的2倍时表明待测菵草材料为抗性材料。第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.菵草CYP704B1基因的以下任一应用：1)在鉴定不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性中的应用；2)作为不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性的标志物中的应用；3)在鉴定抗磺酰脲类除草剂的菵草材料中的应用；其中，所述菵草CYP704B1基因为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)与i)、ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.菵草CYP704B1基因的以下任一应用：1)在鉴定不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性中的应用；2)作为不同菵草材料对磺酰脲类除草剂抗性的标志物中的应用；3)在鉴定抗磺酰脲类除草剂的菵草材料中的应用；其中，所述菵草CYP704B1基因为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)与i)、ii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述磺酰脲类除草剂包括甲基二磺隆。3.用于扩增菵草CYP704B1基因的特异性PCR引物，其特征在于，包括CYP704B1-F1和CYP704B1-R1，核苷酸序列分别如SEQIDNO:2和3所示。4.含有权利要求3所述引物的检测试剂或试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括与所述引物配合使用的荧光染料；优选地，所述荧光染料为SYBRGreenI。6.检测菵草CYP704B1基因表达量的方法，其特征在于，所述方法包括：提取待测菵草总RNA，反转录为cDNA；然后，利用权利要求3所述引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；同时设置内参基因，计算CYP704B1基因的相对表达量。7.根据权利要求6所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔海兰，李香菊，王京京，陈景超，李政，黄兆峰，于惠林，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11