转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法技术

本申请公开了一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。本申请的检测方法，包括同时将油菜品系Ms1外源基因和PEP基因的特异引物和探针加入PCR反应体系中，并加入矿物油，混匀后制成微滴，在微滴中进行双重ddPCR反应，反应结束后，读取每个微滴的扩增信号，计算品系Ms1外源基因和PEP基因的拷贝数；其中，品系外源基因和PEP基因的探针分别用FAM和HEX标记。本申请的检测方法，设计配套使用的内源基因PEP和品系特异性引物探针，采用双通道法，分别定量出两者在油菜基因组中的拷贝数，计算出转基因油菜品系Ms1绝对含量，对油菜转基因成分研究和进出境油菜产品中转基因成分精准定量检测有重要意义。

Reagents, Kits and Detection Methods for Detection of Transgenic Rape Strain Ms1

This application discloses a reagent, kit and detection method for the detection of genetically modified rapeseed strain Ms1. The detection method of this application includes adding the specific primers and probes of the exogenous gene and PEP gene of rape strain Ms1 into the PCR reaction system at the same time, adding mineral oil, mixing them into micro-droplets, and double DD PCR reaction in micro-droplets. After the reaction, the amplified signal of each micro-droplet is read, and the copy number of exogenous gene and PEP gene of strain Ms1 is calculated. The probes of the gene of cause and PEP were labeled with FAM and HEX respectively. In this application, we designed a pair of endogenous gene PEP and strain-specific primer probes to quantify the copies of PEP and strain-specific primer in rapeseed genome by two-channel method, and calculated the absolute content of Ms1, which is of great significance for the research of genetically modified components in rapeseed and the accurate quantitative detection of genetically modified components in import and export rapeseed products.

【技术实现步骤摘要】
转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法
本申请涉及转基因油菜检测领域，特别是涉及一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。
技术介绍
随着生物技术产业的迅速发展，全球转基因作物的研发速度和种植面积持续增加。推进转基因技术已经成为了着眼于未来的发展战略和解决粮食短缺、确保国家粮食安全的必然选择。但是转基因生物安全问题也随之成为世界关注的热点。目前世界各国出于经济、卫生、环保等各种目的纷纷对转基因生物及其产品加强管理和检测。包括中国在内的50个左右国家和地区相继颁布并实行了“转基因标识制度”，对转基因生物及其加工产品进行标识和管理。近年来，随着各国有关GMO(GeneticallyModifiedorganism)标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量下限已有所规定。很多国家不但要求对转基因食品进行定性检测，还需要对食品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。其标识的阈值一般在0.9％–5％之间(EuropeanCommission,2003；Notification,2000)。建立转基因产品的检测技术标准尤其是精准定量检测技术是实施转基因产品标识的技术前提。因此，转基因成分的精准定量技术将随着全世界标识制度的完善和发展日趋重要。现阶段应用最广的定量检测方法是实时荧光PCR(qPCR)，但稳定性、准确性差，所以需要更加精准的检测方法进行替代。数字PCR(dPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因定量技术，用于核酸的绝对拷贝数检测。dPCR通过将常规的荧光PCR反应体系等量均分为相互隔离的大数量微反应体系，通常等量均分为10000个以上的微反应体系，使每个模板独立随机分配至微反应体系中，同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应，根据设定的荧光值判断每个微反应体系的检测结果。最后以实验的阳性与阴性结果的比率进行泊松分布分析，获得荧光PCR反应体系中的模板浓度。与传统qPCR相比，dPCR存在有以下优势:(1)qPCR结果判定依赖扩增曲线的Ct值，容易受到外界影响；而dPCR结果判定不依赖于扩增曲线，只需要判定扩增信号的有无，就可以对样品进行判定，稳定性远强于qPCR；(2)qPCR容易受到基质中抑制因子的影响；而dPCR通过将反应体系进行分割，可以弱化PCR抑制因子对反应结果的影响，从而提高结果判定的稳定性和准确性。目前，数字PCR(dPCR)在科学研究方面已经取得了很大的研究进展，其在临床诊断、拷贝数鉴定、绝对定量等方面取得了很多科研成果。Taly等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测直肠癌病人环状DNA的KRAS突变基因，最终实现了包括野生型的多重样品检测。在植物源制品的检测研究中，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在检测方面的可行性和反应条件，文章表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。Morisset等(2013)利用微滴式数字PCR(ddPCR)检测转基因玉米MON810含量，获得了和定量PCR一致的结果，该结果也间接证明了dPCR技术对于转基因定量检测的贡献。总体而言，dPCR技术目前更多地应用于医学诊断方面，已成为临床应用方面最具潜力的诊断技术之一，并在其它行业取得了突破性研究进展。但是，在转基因检测的研究方面，数字PCR还处于起始阶段，特别是在我国乃至全球各国的标准层面都暂无涉及，这极大制约了数字PCR在实际检测工作上的应用。研究显示，按照种植面积统计，全球约30％的油菜都是转基因产品；然而国际、国内对转基因油菜的特异性定性或定量检测方法却相当缺乏，尤其是对转基因油菜品系Ms1的定量检测，尚未有相关的研究或报道。因此，亟需研究一种有效的转基因油菜品系Ms1检测方法。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种转基因油菜品系Ms1检测的试剂、试剂盒和检测方法。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，包括以下步骤：PCR扩增体系配制步骤，包括将品系Ms1特异引物组、品系Ms1特异探针、PEP基因特异引物组、PEP基因特异探针和待测样品的DNA加入到PCR反应液中，制成双重PCR反应体系；微滴生成步骤，包括在双重PCR反应体系中加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；PCR反应和微滴分析步骤，包括将微滴转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用微滴分析仪读取每个微滴的扩增信号；定量检测步骤，根据读取的扩增信号，采用软件分析品系Ms1的特异扩增拷贝数占内源参考基因PEP基因特异扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系Ms1的含量；品系Ms1特异引物组的正向引物为SeqIDNo.1所示序列，品系Ms1特异引物组的反向引物为SeqIDNo.2所示序列，品系Ms1特异探针为SeqIDNo.3所示序列，PEP基因特异引物组的正向引物为SeqIDNo.4所示序列，PEP基因特异引物组的反向引物为SeqIDNo.5所示序列，PEP基因特异探针为SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG-3’SeqIDNo.2：5’-ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG-3’SeqIDNo.3：5’-TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC-3’SeqIDNo.4：5’-CCCTTGTGAAGCTCGACATC-3’SeqIDNo.5：5’-CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT-3’SeqIDNo.6：5’-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-3’其中，SeqIDNo.3所示序列的品系Ms1特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；SeqIDNo.6所示序列的PEP基因特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。优选的，品系Ms1特异探针中，5’末端的荧光基团为FAM，3’末端的淬灭基团为BHQ-1；PEP基因特异探针中，5’末端的荧光基团为HEX，3’末端的淬灭基团为BHQ-1。需要说明的是，本申请的转基因油菜品系Ms1的检测方法，实际上就是微滴式数字PCR。其原理是，在一个PCR反应管中油水反应体系被微滴发生器制备成近上万个油包水小微滴，当待测DNA模板分子数低于一定的数目，微滴只含有一个分子的DNA模板和足够量的用于荧光PCR反应所需的所有其它组分如dNTP、TaqDNA聚合酶以及探针和引物等。待所有微滴PCR反应结束后，逐一检查每个微滴，只要微滴有荧光信号检出，就被认为有PCR反应发生，记有一个分子的待测模板被检出，统计所有阳性微滴数，就可得出样品中待测DNA模板的分子数或拷贝数。本申请采用双通道法，即分别对油菜品系Ms1特异性探针，以及油菜内源基因特异性探针，采用不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和品系特异序列的拷贝数。其中，本申请检测的内源基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，PCR扩增体系配制步骤，包括将品系Ms1特异引物组、品系Ms1特异探针、PEP基因特异引物组、PEP基因特异探针和待测样品的DNA加入到PCR反应液中，制成双重PCR反应体系；微滴生成步骤，包括在双重PCR反应体系中加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；PCR反应和微滴分析步骤，包括将微滴转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用微滴分析仪读取每个微滴的扩增信号；定量检测步骤，根据读取的扩增信号，采用软件分析品系Ms1的特异扩增拷贝数占内源参考基因PEP基因特异扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系Ms1的含量；所述品系Ms1特异引物组的正向引物为Seq ID No.1所示序列，品系Ms1特异引物组的反向引物为Seq ID No.2所示序列，所述品系Ms1特异探针为Seq ID No.3所示序列，所述PEP基因特异引物组的正向引物为Seq ID No.4所示序列，PEP基因特异引物组的反向引物为Seq ID No.5所示序列，所述PEP基因特异探针为Seq ID No.6所示序列；Seq ID No.1：5’‑CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG‑3’Seq ID No.2：5’‑ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG‑3’Seq ID No.3：5’‑TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC‑3’Seq ID No.4：5’‑CCCTTGTGAAGCTCGACATC‑3’Seq ID No.5：5’‑CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT‑3’Seq ID No.6：5’‑CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA‑3’其中，Seq ID No.3所示序列的品系Ms1特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团；Seq ID No.6所示序列的PEP基因特异探针中，5’末端具有荧光基团，3’末端具有淬灭基团。...

【技术特征摘要】
1.一种转基因油菜品系Ms1的检测方法，其特征在于：包括以下步骤，PCR扩增体系配制步骤，包括将品系Ms1特异引物组、品系Ms1特异探针、PEP基因特异引物组、PEP基因特异探针和待测样品的DNA加入到PCR反应液中，制成双重PCR反应体系；微滴生成步骤，包括在双重PCR反应体系中加入微滴生成油，混匀后，将其转移到微滴生成仪上，震荡生成微滴；PCR反应和微滴分析步骤，包括将微滴转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用微滴分析仪读取每个微滴的扩增信号；定量检测步骤，根据读取的扩增信号，采用软件分析品系Ms1的特异扩增拷贝数占内源参考基因PEP基因特异扩增拷贝数的百分比，以此表示转基因油菜品系Ms1的含量；所述品系Ms1特异引物组的正向引物为SeqIDNo.1所示序列，品系Ms1特异引物组的反向引物为SeqIDNo.2所示序列，所述品系Ms1特异探针为SeqIDNo.3所示序列，所述PEP基因特异引物组的正向引物为SeqIDNo.4所示序列，PEP基因特异引物组的反向引物为SeqIDNo.5所示序列，所述PEP基因特异探针为SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG-3’SeqIDNo.2：5’-ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG-3’SeqIDNo.3：5’-TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC-3’SeqIDNo.4：5’-CCCTTGTGAAGCTCGACATC-3’SeqIDNo.5：5’-CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT-3’SeqIDNo.6：5’-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-3’其中，SeqIDNo.3所示序...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘广，凌杏园，章桂明，刘新娇，向才玉，卢小雨，李芳荣，杨帆，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东,44