一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其应用，涉及水稻育种技术领域。本发明专利技术所述引物组包括正向引物OsALS‑F和反向引物R，所述正向引物OsALS‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。利用所述引物组可快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)，且还具有工作量小、生产成本低等优点。

A group of CAPS marker primers for detection of non-GM herbicide-resistant gene OsALS in rice and its application

The invention provides a set of CAPS marker primers for detecting non-GM herbicide resistant gene OsALS in rice and its application, which relates to the technical field of rice breeding. The primer group of the present invention includes a forward primer OsALS F and a reverse primer R. The nucleotide sequence of the forward primer OsALS F is shown as SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO.2, and the nucleotide sequence of the reverse primer R is shown as SEQ ID NO.3 or SEQ ID NO.4. The new herbicide resistant rice varieties (lines) with different backgrounds can be quickly and accurately selected by using the primers, and the advantages of low workload and low production cost are also provided.

【技术实现步骤摘要】
一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其应用
本专利技术属于水稻育种
，具体涉及一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其应用。
技术介绍
水稻是全球半数以上人口赖以生存的主要粮食作物，对人类生活和粮食安全具有重要意义。我国种植水稻历史悠久，地域广阔，是世界稻米主产国之一。每年种植面积约3500万hm2，约占粮食作物播种面积的29％。在我国所有稻作区的稻田，历来都有大量杂草发生。据统计，全国稻田杂草有200余种，其中发生普遍、为害严重、最常见的杂草约有40种(分布于各稻区为10～20种)。据调查，全国稻田草害在中等以上(2～5级)的面积达1546.7万hm2，其中严重为害(4～5级)面积为380万hm2，分别占水稻种植面积的46.8％和11.5％，损失粮食200多亿kg。农田杂草与作物争夺养料、水分、阳光和空间，妨碍田间通风透光，增加局部气候温度，有些则是病虫中间寄主，促进病虫害发生；寄生性杂草直接从作物体内吸收养分，从而降低作物的产量和品质。此外，有的杂草的种子或花粉含有毒素，能使人畜中毒。近十几年来，杂草稻成为水稻生产中一种新型草害，是杂交水稻的后代或者亲缘关系较远的水稻杂交后代经过自然和人工选择所形成，具有早发芽、早分蘖、早抽穗、早成熟、易落粒、米质差、休眠期弹性大、繁衍速度快以及难以拔除等特点。目前，杂草稻已经成为全球性草害，在一些国家，杂草稻造成水稻减产10～15％。在我国，水稻播种面积中杂草稻实际发生面积约占20％，产量平均损失在10％左右，年损失超过100亿元，被称为水稻杀手。因此，防除杂草稻成为目前水稻生产中亟待解决的问题，对于提高水稻的产量和品质有重要的意义。对稻田杂草和杂草稻的防除主要有手工拔草、农具除草及化学除草等手段。手工拔草和农具除草耗力多、工效低，不能大面积及时防除。因此，利用除草剂防除田间杂草和杂草稻是一条最有效途径。乙酰乳酸合成酶(ALS)是支链氨基酸合成途径中的首要关键酶，以其作为靶标的除草剂分为：磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类和磺酰胺类。这类除草剂具有高活性、杀草广谱和选择性强等特点，是目前防治稻田杂草、再生稻、杂草稻较理想的除草剂。近年来，科学家们通过多种途径获得了一批非转基因抗除草剂水稻突变体，其中一些抗性表现较好的种质材料，已被成功应用于水稻育种。系谱选育法是当前最为普遍的水稻育种方法，其通过不同亲本配组杂交，获得F1代杂交种，从F2分离世代开始在各世代进行单株选择，直至选出性状符合要求且稳定一致的品系，按系混合收获，经鉴定比较而育成水稻新品种。该育种方法具有操作简单、目标性强的优点，但由于主要依靠看、嗅、摸等方法模糊把握表型性状的优劣，把握准确性较差，一些重要基因在选育过程中容易丢失。目前，运用传统的系谱法选育抗除草剂水稻品种，只能通过喷施除草剂的办法进行抗性鉴定，抗性表型出现需要15～30天时间。在实践过程中受制于喷施时期、喷施浓度、除草剂药效及环境温度、水体等各种因素影响，其抗性稳定性较差、鉴定风险大，且抗性育种年限长、工作量大、生产成本较高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其在水稻育种中的应用，可以快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)，且还具有工作量小、生产成本低等优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组，所述引物组包括正向引物OsALS-F和反向引物R，所述正向引物OsALS-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。优选的，所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记酶切位点位于水稻第2号染色体第18237999bp处，多态性表现为G/A碱基差异。本专利技术还提供了上述CAPS标记引物组在水稻育种中的应用。本专利技术还提供了上述CAPS标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。本专利技术还提供了上述CAPS标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。优选的，所述CAPS标记引物组通过PCR的方式进行应用。优选的，所述PCR的方法包括以下步骤：(1)以水稻基因组DNA为模板DNA进行PCR反应，得PCR扩增产物；(2)将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分进行酶切反应；(3)酶切所述PCR产物后琼脂糖凝胶电泳；根据所述酶切产物的带型判断OsALS的等位基因型，所述PCR扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如下表所示：优选的，步骤(1)所述PCR的反应体系以20μL计，包括10μL2×TaqPCRMasterMix，1μL模板DNA，正、反向引物各1μL和7μLddH2O。优选的，步骤(1)所述PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸8min，4℃保存。优选的，步骤(3)所述酶切的反应体系以10μL计，包括0.3μL限制酶、1μLbuffer、5.7μLddH2O和3μLPCR产物。本专利技术提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组，利用SNP分子标记进行基因型检测，可以快速、准确地鉴定水稻对咪唑啉酮类除草剂的抗性水平，减少了播种、喷施除草剂、抗性调查等辛苦操作，显著提高非转基因抗除草剂水稻品种的培育效率，同时避免了由于田间操作失误及水体污染等导致其他育种材料致死的风险。本专利技术所述引物组能够准确地鉴定水稻咪唑啉酮类除草剂抗性。利用本专利技术所述引物组进行水稻育种时，检测方法准确可靠，操作简便，能够更简单预测水稻除草剂抗性，从而更好的服务非转基因水稻品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为抗除草剂水稻品种选育或改良提供了科学依据。本专利技术减少了农事操作，缩短了鉴定时间，提高检测准确性。附图说明图1为4组引物PCR扩增产物电泳图；图2为Xsp1酶切产物电泳图；图3为Spe1酶切产物电泳图。具体实施方式本专利技术提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组，所述引物组包括正向引物OsALS-F和反向引物R，所述正向引物OsALS-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。本专利技术所述CAPS标记引物组的PCR扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如表1所示。表1CAPS标记引物组信息在本专利技术中，所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记位点位于水稻第2号染色体第18237999bp处，多态性表现为G/A碱基差异。本专利技术还提供了上述CAPS标记引物组在水稻育种中的应用。本专利技术所述应用优选包括通过化学诱变和抗性筛选，获得抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体，将其与主栽水稻品种杂交，借助分子标记跟踪检测，可以快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)。水稻OsALS基因分子标记的设计和应用在实验室完成，避免了各种因素影响，3～4天即可准确鉴定出基因型。本专利技术所述鉴定优选通过PCR的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组，其特征在于，所述引物组包括正向引物OsALS‑F和反向引物R，所述正向引物OsALS‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组，其特征在于，所述引物组包括正向引物OsALS-F和反向引物R，所述正向引物OsALS-F的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。2.根据权利要求1所述CAPS标记引物组，其特征在于，所述水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记酶切位点位于水稻第2号染色体第18237999bp处，多态性表现为G/A碱基差异。3.权利要求1或2所述CAPS标记引物组在水稻育种中的应用。4.权利要求1或2所述CAPS标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。5.权利要求1或2所述CAPS标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。6.根据权利要求3～5任一项所述应用，其特征在于，所述CAPS标记引物组通过PCR的方式进行应用。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述PCR的方法包...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，李磊，林参，袁彩勇，王健，程保山，王迪，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32