本发明专利技术公开了一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的InDel分子标记特异性引物，它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列。本发明专利技术进一步公开了利用特异性引物鉴定速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的方法。本发明专利技术提供的特异性引物及方法，可以在实验室3‑5小时完成不结球白菜速俊316杂交种种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于速俊316不结球白菜杂交种种子高效准确的质量控制。
A Primer for Identification of Seed Purity of Non-heading Chinese Cabbage Sujun 316 and Its Application
The invention discloses an InDel molecular marker specific primer for detecting seed purity of Sujun 316 non-heading Chinese cabbage hybrid seeds, which is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1_2. The invention further discloses a method for identifying the purity of hybrid seeds of Sujun 316 non-heading Chinese Cabbage by using specific primers. The specific primers and methods provided by the invention can complete the seed purity identification of the non-heading Chinese cabbage Sujun 316 hybrid seeds in 3 to 5 hours in the laboratory, and have the advantages of rapidity, stability and no environmental impact. The method can replace the traditional field seed purity identification method, and is conducive to the high-efficiency and accurate quality control of the non-heading Chinese cabbage hybrid seeds of Sujun 316.
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定不结球白菜速俊316种子纯度的引物及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种鉴定不结球白菜速俊316杂交种种子纯度的引物序列及应用。
技术介绍
不结球白菜（BrassicarapaL.ssp.chinensisMakino）属十字花科芸薹属作物，又名小白菜、青菜、油菜（我国北方地区），原为我国长江中下游及以南地区的一种全年四季种植和供应的蔬菜，现已成为一种重要的全国性绿叶蔬菜，并且在日本、韩国等国外的种植面积也越来越大。不结球白菜传统的种子纯度鉴定方法，一般采取田间种植，待生长到特定时期，观察生长特性，鉴定种子的纯度，具有周期长、用工量大、易受环境影响等缺点。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种技术在农业育种中的应用越来越广，利用InDel分子标记，可以直接鉴定样品间基因组DNA水平的差异，用于鉴定种子的纯度，具有用时短、重复性好、不受环境影响等优点。速俊316是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的不结球白菜系列杂交种之一，具有生长速度快，束腰早，株型美观，产量高，适收期长，品质佳等特点。该品种叶色鲜绿，叶柄较短，宽厚亮泽，无蜡粉，抗病性强，适应性广。该品种一直采用传统的田间方法鉴定种子纯度，经常造成种子纯度鉴定时间与销售周期相冲突。需要开发一种快速、准确的种子纯度鉴定方法，以适应速俊316的推广及用种量的增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的InDel标记的引物序列及应用，为实现该目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物，其特征在于它为SEQIDNO:1-2所示的核苷酸序列：ATGCTTGGAGATGAGACATGGATCAAGSEQIDNO:1TTGCTCATATCACCATCATACAGATAGGGSEQIDNO:2。本专利技术进一步公开了采用所述的特异性引物检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）提取速俊316杂交种待测样品的基因组DNA；（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以标记引物为特异性引物进行PCR扩增；反应体系为：10µL体系，包括：10×PCRBuffer，1.0µL；2.5mMdNTP，0.2µL；10µmol·L-1primers，0.4µL；5U·µL-1Taq，0.2µL；50ng·µL-1DNA，1.5µL；ddH2O，6.7µL。采用的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min；所述的特异性引物为：ATGCTTGGAGATGAGACATGGATCAAGSEQIDNO:1TTGCTCATATCACCATCATACAGATAGGGSEQIDNO:2；（3）将上述PCR扩增获得的产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；（4）统计上述银染的结果：同时含有父本和母本双亲材料条带的种子为杂交种的种子，只含有母本或父本材料条带的为非杂交种的种子，所检测速俊316杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。本专利技术更进一步公开了检测方法在用于快速准确速俊316不结球白菜杂交种种子纯度方面的应用。实验结果显示：本专利技术可以快速、准确地鉴定速俊316不结球白菜杂交种种子纯度。本专利技术主要解决了速俊316不结球白菜杂交种种子纯度传统田间鉴定方法用时长、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发速俊316不结球白菜杂交种种子父本与母本间具有多态性、稳定性好、易区分的分子标记引物。本专利技术公开的用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物及应用与现有技术相比，所具有的积极效果在于：通过本专利技术提供的特异性引物及应用，可在实验室内3-5小时完成速俊316杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于速俊316商品种种子高效准确的质量控制及该品种的进一步推广。附图说明图1为InDel引物A10-2在津研快绿1号父本、母本及杂交种样品的电泳图；M表示DNAMarker，1-3为速俊316父本的三个重复材料，4-5为速俊316母本材料的三个重复材料，7-9为速俊316杂交种的三个重复材料；图2为利用InDel引物检测速俊316杂交种46个样品纯度的电泳图；M表示DNAMarker，P1表示父本材料，P2表示母本材料，其余为杂交种材料，其中三角所在位置表示该材料为非杂交种材料，其余都为杂交种材料。具体实施方式除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料NS07、母本材料KR08可向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组索取，速俊316不结球白菜杂交种有市售。实施例1一、纯度鉴定InDel引物的筛选根据大白菜基因组重测序数据，设计多对引物，对速俊316、父本、母本各三个单株进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对A10-2，序列如下:F:5’-ATGCTTGGAGATGAGACATGGATCAAG-3’(SEQIDNO:1)R:5’-TTGCTCATATCACCATCATACAGATAGGG-3’(SEQIDNO:2)该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可扩增出133bp的特异性条带，在母本材料中能够扩增出104bp的特异性条带，速俊316杂交种材料中同时扩增出133bp和104bp的特异性条带，如图1所示。二、速俊316种子纯度鉴定1.待测样品基因组DNA的提取材料为父本、母本材料，以及来源于制种基地5户签约农户生产的速俊316杂交种。利用CTAB法提取母本材料、父本材料，以及速俊316杂交种待测样品92株的叶片基因组DNA，具体步骤如下：取幼嫩叶片0.2g入1.5mL离心管中，加50μL2%CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400μL，65℃水浴30min；加入400μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5min。12000rpm离心5min；取上清200μL，加入预冷的异丙醇200μL混匀，-20℃放置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入150μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100μL溶解DNA，室温放置1h；用蒸馏水将DNA稀释到50ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。2.PCR扩增：以上述待测样品的基因组DNA为模板，以本专利技术提供的InDel引物为特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物。采用的反应体系为：10µL体系，包括：10×PCRBuffer，1.0µL；2.5mMdNTP，0.2µ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物，其特征在于它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列：ATG CTT GGA GAT GAG ACA TGG ATC AAG SEQ ID NO:1TTG CTC ATA TCA CCA TCA TAC AGA TAG GG SEQ ID NO:2。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的特异性引物，其特征在于它为SEQIDNO:1-2所示的核苷酸序列：ATGCTTGGAGATGAGACATGGATCAAGSEQIDNO:1TTGCTCATATCACCATCATACAGATAGGGSEQIDNO:2。2.一种采用权利要求1所述的特异性引物检测速俊316不结球白菜杂交种种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）提取速俊316杂交种待测样品的基因组DNA；（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以InDel标记引物为特异性引物进行PCR扩增；反应体系为：10µL体系，包括：10×PCRBuffer，1.0µL；2.5mMdNTP，0.2µL；10µmol·L-1primers，0.4µL；5U...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志银，王超楠，李梅，华德平，张红，范伟强，张斌，刘晓晖，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12
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