白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3的分子标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3的分子标记引物及其应用。BrHMA3在GenBank中的登录号为XM_009139644。该基因可将白菜吸收进入根部细胞中的离子态的镉截获至液泡中储存，从而减少重金属镉在白菜地上部可食用部位的积累。本发明专利技术发现在白菜自然变异品种中，可以根据氨基酸序列差异将BrHMA3划分为9种类型，通过对高镉积累品种和低镉积累品种中BrHMA3蛋白序列的分析，可以针对不同的多态性位点，设计分子标记，进而直接通过PCR技术分析白菜品种中BrHMA3的单倍型，推测其镉积累性状，从而选育地上可食部位低镉积累的品种。本发明专利技术可以快速有效的鉴别白菜镉的积累性状。

Molecular Marker Primers of Cadmium Transporter Coding Gene BrHMA3 in Chinese Cabbage and Its Application

The present invention discloses a molecular marker primer of the cadmium transporter coding gene BrHMA3 in Chinese cabbage and its application. The login number of BrHMA3 in GenBank is XM_009139644. This gene can intercept the ionic cadmium absorbed into the root cells of Chinese cabbage and store it in vacuoles, thus reducing the accumulation of heavy metal cadmium in the edible parts of the aboveground parts of Chinese cabbage. The invention found that BrHMA3 can be divided into nine types according to the difference of amino acid sequence in natural variation varieties of Chinese cabbage. By analyzing the sequence of BrHMA3 protein in high cadmium accumulation varieties and low cadmium accumulation varieties, molecular markers can be designed for different polymorphic loci, and then haplotypes of BrHMA3 in Chinese cabbage varieties can be analyzed directly by PCR technology, and cadmium accumulation characteristics can be inferred. Therefore, the cultivars with low cadmium accumulation in edible parts above ground were selected. The invention can quickly and effectively identify cadmium accumulation characteristics of Chinese cabbage.

【技术实现步骤摘要】
白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3的分子标记引物及其应用
本专利技术属于农业生物
，涉及白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3的分子标记引物及其应用。
技术介绍
镉(Cadmium)作为一种有害重金属，是主要的环境污染物之一。镉在人体中储存，半衰期可达30-50年，并且积累在人体骨骼和肾脏器官，引起骨质疏松和肾功能不全等健康疾病(Akessonetal.2014；Chenetal.2018b；Chenetal.2018a)。据统计，非吸烟人群中，镉摄入的途径90％来自稻谷类、叶菜类的饮食摄入(EFSA2009)，中国人口平均镉摄入贡献量前三位是：水稻(55.8％)，小麦粉(11.8％)和叶菜类(10.9％)(Songetal.2017)。镉在土壤中的积累以及根部向地上部的转移比是粮食作物污染的重要影响因子(Clemens2006；Zhaoetal.2015；ClemensandMa2016)。不同作物以及相同作物中的不同种质差异对植物从根部吸收镉以及向地上部转移都存在影响。其中已报道的拟南芥中的AtHMA3(Moreletal.2009；Gravotetal.2004)和水稻中的OsHMA3基因(DaiseiUenoa2010；Kumagaietal.2014；Miyadateetal.2011；Yanetal.2016)都会将植物根部吸收的镉转移至根部液泡中储存，从而减少植物地上部可食部位的重金属积累。酶切扩增多态性序列(cleavedamplifiedpolymorphicsequence，CAPS)标记是结合了特异引物PCR与限制性酶切技术的一种检测SNP位点的DNA标记方法。其原理是SNP突变位点位于某种特定内切酶的识别序列上，经过特异性引物进行PCR扩增后，用相应内切酶对PCR产物进行酶切，从而产生酶切片段的多态性，这样通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色即可显示。而以CAPS为基础，人工引入错配碱基的衍生酶切扩增多态性标记(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequence，dCAPS)，大大提高了将所有SNP位点转换成可以电泳检测的标记的可行性。CAPS以及dCAPS，均具有共显性、位点特异性、操作简单、检测快速、成本低廉且不依赖于精密仪器设备等特点，可用于植物基因分型、定位、遗传多样性分析、品种鉴定等方面。目前，白菜中与重金属镉吸收和转运相关的基因及其分子机制的报道很少，本专利技术基于白菜中的BrHMA3基因9种单倍型，结合PCR技术和限制性内切酶酶切技术，为白菜中的BrHMA3基因的功能验证提供了鉴定的分子标记，该分子标记可以快速有效的为低镉积累白菜品种的选育提供参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供白菜镉转运蛋白编码基因。本专利技术的目的是提供该基因的分子标记设计及应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一组鉴定白菜中丧失镉转运功能的镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型的分子标记引物，选自以下任意一种：(1)SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type6单倍型的分子标记引物；以白菜品种的基因组DNA或者cDNA为模板，通过SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的引物进行扩增，NheI酶切PCR产物，未丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type1单倍型得到一条大小为157bp的谱带，丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type6单倍型苏州青则得到一条大小为140bp的谱带；(2)SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type7单倍型的分子标记引物；以白菜品种的基因组DNA或者cDNA为模板，通过SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的引物进行扩增，未丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type1单倍型得到一条416bp大小的谱带，丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type7单倍型L58得到一条315bp大小的谱带；(3)SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type8单倍型的分子标记引物；以白菜品种的基因组DNA或者cDNA为模板，通过SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的引物进行扩增，NheI酶切PCR产物，未丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type1单倍型得到一条大小为216bp的谱带，丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type8单倍型夏抗40品种则得到一条大小为240bp的谱带；(4)SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type9单倍型的分子标记引物；以白菜品种的基因组DNA或者cDNA为模板，通过SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的引物进行扩增，AluI酶切PCR产物，未丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type1单倍型Chiifu得到一条大小为148bp的谱带，而丧失镉转运功能的BrHMA3基因Type9单倍型津绿75品种则得到一条大小为127bp的谱带。本专利技术所述的分子标记引物在分离丧失BrHMA3镉转运功能的白菜高镉品种中的应用。本专利技术所述的分子标记引物在白菜低镉积累品种的选育中的应用。镉转运蛋白编码基因BrHMA3在地上部分低镉白菜品种选育中的应用，所述的镉转运蛋白编码基因BrHMA3序列如SEQIDNO.15、SEQIDNO.20～SEQIDNO.23中任一种所示。白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型1，GenBank中的登录号为XM_009139644，序列如SEQIDNO.15所示。所述的BrHMA3基因编码区扩增引物序列为：正向引物序列(5’-3’)：ATGGCCAACGTTGAAGAGACAAC(SEQIDNO.1)反向引物序列(5’-3’)：TCAGAAACTCTCTAAGTCCCCTGTTT(SEQIDNO.2)所述的BrHMA3蛋白氨基酸序列是将测序所得的核苷酸序列翻译所得。白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型6，核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型7，核苷酸序列如SEQIDNO.21所示。白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型8，核苷酸序列如SEQIDNO.22所示。白菜镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型9，核苷酸序列如SEQIDNO.23所示。本专利技术的有益效果：1.本专利技术通过系统研究，首次提供了一种白菜中镉转运蛋白编码基因BrHMA3及其生物学功能。2.首先通过水培实验对64个白菜自然变异品种中的镉吸收和分配能力进行分析，发现自然变异群体中的镉分布存在着巨大的差异。其中地上部叶片中的镉差异为8.5倍，根部差异为25.1倍，而计算所得从根部到地上部的转运系数差异可达46.5倍(表1-3)。3.本专利技术通过结合聚合酶链式反应结合DNA测序技术获取了64个不同的白菜自然变异品种的BrHMA3基因序列，并通过分析氨基酸序列，获取了9种不同的BrHMA3基因单倍型(图1)。4.9种基因单倍型结合水培生理实验结果，发现其中含5种低镉转运类型和4种高镉转运类型(图1)。5.构建不同单倍型BrHMA3::pYES2酵母表达载体，探究BrHMA3不同基因单倍型对镉的转运差异。6.通过酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组鉴定白菜中丧失镉转运功能的镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型的分子标记引物，其特征在于选自以下任意一种：(1)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type6单倍型的分子标记引物；(2)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type7单倍型的分子标记引物；(3)SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type8单倍型的分子标记引物；(4)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type9单倍型的分子标记引物。

【技术特征摘要】
1.一组鉴定白菜中丧失镉转运功能的镉转运蛋白编码基因BrHMA3单倍型的分子标记引物，其特征在于选自以下任意一种：(1)SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type6单倍型的分子标记引物；(2)SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type7单倍型的分子标记引物；(3)SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type8单倍型的分子标记引物；(4)SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的用于鉴定BrHMA3基因Type1和Type9单倍型的分子标记引物。2.权利要求1所述的分子标记引物在分离丧失BrHMA3镉转运功能的白菜...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方杰，张凌霄，武剑，唐仲，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32