检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测慢性关节炎病的生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物或真菌其他成分中的一种或多种，并提出了检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，通过检测慢性关节炎病人人体生物样本中是否存在该生物标志物以及生物标志物的种类，进而作为慢性关节炎病的病因分类辅助诊断、病程观测、治疗方案或预后判断的依据。本发明专利技术公开了一种检测慢性关节炎病的生物标志物的检测方法。开辟了慢性关节炎的治疗、根治和预防的新靶点。

Biomarkers, Application and Detection of Chronic Arthritis

The invention discloses a biomarker for detecting chronic arthritis as one or more of pathogenic fungi, specific nucleic acid sequences of pathogenic fungi and fungal secretions or other components of fungi in human biological samples, and advances the application of a biomarker for detecting chronic arthritis, by detecting whether the organism exists in human biological samples of patients with chronic arthritis. The types of biomarkers and biomarkers can be used as the basis of etiological classification, auxiliary diagnosis, course observation, treatment plan or prognosis judgment of chronic arthritis. The invention discloses a detection method for biomarkers of chronic arthritis disease. It opens up a new target for the treatment, cure and prevention of chronic arthritis.

【技术实现步骤摘要】
检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法
本专利技术涉及生物标志物
，具体涉及一种检测慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法。
技术介绍
人类关节炎的发病率大约为20-30％(2017年，美国有5400万关节炎患者，占成年人25％)，既全世界当前大约有10多亿人患有关节炎。人类慢性关节炎病的病理机制、关节炎特征、治疗和预后都很相似，目前它们的致病病理机制被认为是遗传因素和环境因素。除创伤性关节、感染性关节炎等已知病因、病原的关节炎外，大多数慢性关节炎病慢性反复发作、多发关节炎，其中包括类风湿关节、银屑病关节炎、强直性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮等结缔组织疾病或自身免疫性疾病的关节炎。早期的主要表现是关节僵直、疼痛、肿胀等多关节滑膜炎症状的表现，特别是指关节受累；晚期累及骨关节，导致骨关节疼痛、变形及全身各脏器受累。由于类风湿性关节炎和银屑病尚未有明确的致病病因，慢性关节炎病目前仍是终身性慢性病，被认为是遗传-环境多因素导致自身免疫性疾病，不能治愈，仅仅对症治疗，缓解病情。因此，实现慢性关节炎病更早的诊断、治疗和改善预后及分类，需要发现和明确病因及致病机制，根据病因分类能够实现高灵敏度的分类诊断检测慢性关节炎病的生物标志物。
技术实现思路
针对现有慢性关节炎病的诊断、治疗中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种检测部分病因不明慢性关节炎病的生物标志物、应用及检测方法，可实现慢性关节炎诊断分类。为达到以上目的，本专利技术提供了一种检测慢性关节炎病的分类生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物中的一种或多种。所述致病真菌的特异性核酸序列为聚多曲霉5.8SribosomalRNA基因或聚多曲霉全基因组。所述聚多曲霉5.8SribosomalRNA基因为SEQIDNO:3所示序列。所述聚多曲霉全基因组为SEQIDNO:4所示序列。所述真菌分泌物包括蛋白和/或蛋白组，任选地，所述真菌分泌物包括曲霉半乳甘露聚糖。在上述技术方案的基础上，本专利技术还提供了检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，通过检测人体生物样本中是否存在所述生物标志物，作为慢性关节炎病的病因分类诊断、病程、治疗或预后依据。通过检测人体生物样本中的所述生物标志物的种类和计量，对慢性关节炎进行分类。本专利技术还提供了慢性关节炎病的生物标志物的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括感染局部真菌培养法、真菌核酸检测法、真菌蛋白免疫检测法。所述真菌核酸检测法包括：提取待测样本，PCR扩增、DNA测序、循环血中游离DNA检测；所述真菌蛋白免疫检测法包括：蛋白电泳、蛋白印记酶标检测法和/或蛋白化学或免疫学检测法。所述血清真菌感染测法包括：抗凝采血，血清真菌成分检测，包括1,3-β-D葡聚糖检测(简称G试验)和半乳甘露聚糖(简称为GM试验)所述真菌培养法包括以下步骤：提取待测样本，真菌培养，肉眼或显微镜观察；若所述样本出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若所述样本未出现霉菌或菌丝，将所述未出现霉菌或菌丝的样本进行无菌组织培养，观察；更换新鲜培养液，真菌培养，肉眼或显微镜观察；若出现霉菌或菌丝，确认存在生物标志物，若未出现霉菌或菌丝，确认无真菌感染。待测样本包括皮肤表皮、血液、体液或真菌感染组织。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术公开了慢性关节炎的生物标志物为致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物中的一种或多种，并提出了通过检测人体生物样本中生物标志物的存在与否和生物标志物的种类，进而作为慢性关节炎病的诊断、病程、治疗或预后依据，可实现慢性关节炎的诊断分类。附图说明图1为本专利技术实施例人体生物样本中的致病真菌的检测方法的流程示意图；图2为本专利技术实施例人体生物样本中的致病真菌的检测步骤中培养出的菌丝以及真菌菌丝从人表皮细胞中长出的显微镜下观察图；图3为真菌-表皮杂交细胞电镜图，1为真菌细胞核，2为细胞膜，3为内质网，4为线粒体；图4为本专利技术实施例聚多曲霉的5.8SribosomalRNA基因的PCR扩增的电泳图；图5为免疫组化染色的关节炎病人皮肤表皮细胞组织(B)与正常皮肤表皮细胞组织(A)对比图，其中B1和B2是图B的局部放大图；图6为真菌分泌蛋白的电泳图；图7为真菌分泌蛋白的印记酶标检测图。具体实施方式以下结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1：慢性关节炎病的生物标志物的应用通过检测人体生物样本中是否存在生物标志物，作为慢性关节炎病的病因诊断、病程、治疗或预后依据。通过检测人体生物样本中的所述生物标志物的种类和计量，对慢性关节炎进行分类。皮下注射真菌分泌蛋白量1.0mL、过滤灭菌的真菌培养液或过滤纯化-浓缩真菌分泌蛋白溶液(200μL)。纯化的蛋白溶液在SDS-PAGE图像定量检测含有大约30种分泌蛋白的混合物，每个蛋白定量大约为0.01至1.5μg/mL。每天注射一次，连续9天，诱发关节炎症状。实施例2：用标志物来辅助关节炎分类诊断如图1，从脚底皮肤剪削湘雅病变组织，(湘雅病变即皮肤表皮细胞的细胞内和细胞外真菌感染引起的皮肤病变)，切成两片，分别放入6孔板的A孔和B孔中，加入2.5mL无血清培养液，在37℃培养5日；肉眼或显微镜下观察是否出现霉菌或菌丝，若出现，则确定存在真菌感染，若没有出现，继续在37℃培养5日，观察是否形成肿瘤样组织；更换新鲜培养液后，继续培养5日，观察肿瘤样组织和非肿瘤样组织之外的病变组织，是否出现霉菌或菌丝，如果出现，则确定存在真菌感染。图2为显微镜下观察的菌丝，图3为真菌-表皮杂交细胞电镜图，见人体病变上皮中有真菌真菌成分1为真菌细胞核，2为细胞膜，3为内质网，4为线粒体。电镜检测真菌-表皮杂交细胞(僵尸细胞)见人类表皮细胞内散在的多个真菌细胞核。这样的细胞能分泌真菌蛋白到关节炎病人的血循环中到关节，引起关节炎病对慢性关节炎病因分类诊断。实施例3：真菌核酸检测法检测慢性关节炎病的生物标志物真菌核酸检测法包括：提取真菌感染组织，进行PCR扩增、DNA测序、循环血中游离DNA检测，检测扩增产物中是否包括致病真菌的特异性核酸序列，以确定是否存在生物标志物。在皮肤真菌感染(湘雅病变)处表面清洗、消毒处理，取其表皮组织100-200mg，研磨成碎粉后加入100μL细胞溶解液(5mMEDTA,10mMTris.HClpH7.5,ProteinaseK200μg)，用液氮冷冻。加入1μL引物1(1μg/μL)、1μL引物2(1μg/μL)，2μLdNTP(100mM)混合，再加入2μL缓冲液、1μLTaq聚合酶，加水至溶液20μL，控制细胞裂解和DNA变性温度为95℃，时长7min，搅拌并控制温度分别为62℃1min，72℃3min，94℃1min，反应末控制温度72℃7min。取2μL反应产物，加入2μL上样缓冲液(2X)，上样至1.5％琼脂糖凝胶，电泳30min，凝胶成像。扩增DNA片段测序。5.8SribosomeRNA基因序列：TGTTCTGGGAATGCGGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物或真菌其他成分中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为人体生物样本中的致病真菌、致病真菌的特异性核酸序列和真菌分泌物或真菌其他成分中的一种或多种。2.如权利要求1所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述致病真菌的特异性核酸序列为聚多曲霉5.8SribosomalRNA基因或聚多曲霉全基因组。3.如权利要求2所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述聚多曲霉5.8SribosomalRNA基因为SEQIDNO:3所示序列。4.如权利要求2所述的一种检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述聚多曲霉全基因组为SEQIDNO:4所示序列。5.如权利要求1所述的检测慢性关节炎病的生物标志物，其特征在于：所述真菌分泌物包括蛋白和/或蛋白组或真菌其他成分，任选地，所述真菌分泌物包括曲霉半乳甘露聚糖和1,3-β-D葡聚糖。6.一种如权利要求1～5任意一项所述的检测慢性关节炎病的生物标志物的应用，其特征在于：通过检测关节炎病人人体生物样本中是否存在所述生物标志物，作为慢性关节炎病的病因诊断分类、病程观察、治疗选择或预后评估依据。7.一种如权利要求1～5任意一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱小湘，
申请(专利权)人：武汉愔紫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42