利用替代的葡萄糖转运蛋白产生鼠李糖脂的细胞和方法技术

本发明专利技术涉及产生鼠李糖脂并经遗传修饰的细胞，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加，并且涉及利用本发明专利技术的细胞制备鼠李糖脂的方法。

Cells and methods for producing rhamnolipids by substituted glucose transporters

The present invention relates to cells that produce rhamnolipid and are genetically modified, thereby reducing the activity of ABC glucose transporter compared with its wild type, and increasing the activity of at least one non-ABC glucose transporter compared with its wild type, and to a method for preparing rhamnolipid by using the cells of the present invention.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用替代的葡萄糖转运蛋白产生鼠李糖脂的细胞和方法专利
本专利技术涉及产生鼠李糖脂的细胞，所述细胞经遗传修饰，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加，并且涉及利用本专利技术的细胞制备鼠李糖脂的方法。现有技术鼠李糖脂是一类具有经济利益的物质，因为它们可能取代传统的石油基表面活性剂，从而提高相应制剂的环境相容性。现在利用各种人病原和动物病原细菌的野生型分离株制备鼠李糖脂，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和伯克氏菌属(Burkholderia)的代表(参见HandbookofHydrocarbonandLipidMicrobiology,2010,pages3037-51)。WO2012013554公开了在非病原生物体如恶臭假单胞菌(P.putida)KT2440中产生鼠李糖脂，其中，例如，表达铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)基因rhlA、rhlB和rhlC编码的酶。最高效生产方法的开发和建立尤其需要获得最高的可能的时空收率。本专利技术的目的是开发微生物细胞以及利用这类细胞的方法，其中实现了高时空收率。专利技术描述令人惊讶的是，据发现产生鼠李糖脂并经遗传修饰的细胞(从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加)在底物输入相当的情况下提供比具有功能性ABC转运蛋白的比较菌株高的鼠李糖脂时空收率。因此本专利技术提供鼠李糖脂生成细胞，特征在于它们经遗传修饰，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加。本专利技术进一步提供一种利用上述细胞作为生物催化剂制备鼠李糖脂的方法。本专利技术的一个优点是可以使用不是病原且容易培养的生物体。本专利技术的另一优点是可以使用大量可选择的(alargeselectionof)碳源。进一步的优点是不必在所有情况下使用油作为唯一底物或作为共底物。另一优点是可以借助本专利技术制备具有明确的和可调节的特性的鼠李糖脂。进一步的优点是可以以比这些活性没有改变的细胞高的时空和碳收率制备鼠李糖脂。因此本专利技术提供鼠李糖脂生成细胞，优选分离的鼠李糖脂生成细胞，特征在于它们经遗传修饰，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加。术语细胞的“野生型”在这里表示这样的细胞，其基因组以通过进化天然产生的状态存在。该术语用于整个细胞和单个基因。因此，具体地，术语“野生型”不包括那些基因序列已被人通过重组技术至少部分修饰的细胞或基因。具体地，术语“野生型”表示在生物的自然群体中数量上出现最频繁的表型、基因型或基因。在本专利技术的上下文中，术语“鼠李糖脂”理解为表示通式(I)的化合物或其盐，其中m＝2、1或0，特别是1或0，n＝1或0，特别是1，R1＝具有2-24个碳原子，优选5-13个碳原子的有机基团(organicradical)，特别是任选支化的，任选取代的，特别是羟基取代的，任选不饱和的，特别是任选地单不饱和、二不饱和或三不饱和的烃基，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基和(CH2)o-CH3(其中o＝1-23，优选4-12)的一种，并且R2＝互相独立地，相同或不同的，具有2-24，优选5-13个碳原子的有机基团，特别是任选支化的，任选取代的，特别是羟基取代的，任选不饱和的，特别是任选单不饱和、二不饱和或三不饱和的烃基，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一碳烯基和十三碳烯基和(CH2)o-CH3(其中o＝1-23，优选4-12)的一种。如果本专利技术的细胞能够产生其中m＝1的鼠李糖脂，优选通过R1和R2确定的自由基是源自3-羟基辛酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二酸、3-羟基十二酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二烯酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烯酸、3-羟基十四酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四酸、3-羟基十四酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烯酸、3-羟基十四烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十二酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基十二酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十二烯酸、3-羟基十二酰基-3-羟基十四酸、3-羟基十四酰基-3-羟基十二酸、3-羟基十四酰基-3-羟基十四酸、3-羟基十六酰基-3-羟基十四酸、3-羟基十四酰基-3-羟基十六酸或3-羟基十六酰基-3-羟基十六酸。对本领域技术人员明显的是，本专利技术的细胞还能够产生各种通式(I)的鼠李糖脂的混合物。在这方面，优选本专利技术的细胞能够产生通式(I)的鼠李糖脂的混合物，特征在于在产生的鼠李糖脂的超过80重量％，优选超过90重量％，特别优选超过95重量％中n＝1，并且在产生的鼠李糖脂的少于20重量％，优选少于15重量％中通过R1和R2确定的基团(radical)源自3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸或3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸，指定的重量％基于产生的通式(I)的所有鼠李糖脂的总和。本专利技术的上下文中列出的登录号对应于日期为26.01.2016的NCBI的蛋白库数据库条目；一般来说，在目前情况下，条目的版本号通过“.数字”鉴定，例如，“.1”。除非另有说明，给出的所有百分比(％)是质量百分比。因此使用的表述“酶Ex的活性降低”理解为表示优选活性降低至少0.5的因数，特别优选至少0.1，进一步优选至少0.01，进一步优选至少0.001，并且最优选至少0.0001。表述“活性降低”还包括没有可检测的活性(“0的活性”)。降低微生物中的酶促活性的方法是本领域技术人员已知的。分子生物学技术在这里特别有用。例如，可以通过本领域技术人员已知用于减少某种酶活性的靶向突变或其他措施减少某种酶的活性。本领域技术人员可以例如在Dubeauetal.2009.BMCMicrobiology9:263；Singh&Microbiology.2008.154:797-809或Leeetal.FEMSMicrobiolLett.2009.297(1):38-48中找到假单胞菌属和伯克氏菌属特异性地修饰和减少蛋白表达以及相关酶活性降低的指导，特别是干扰(interrupt)特定基因的指导。降低下文描述的ABC葡萄糖转运蛋白的酶促活性的优选方式可以相似地优选用于在本专利技术的上下文中待降低的其他酶活性。根据本专利技术优选的细胞的特征在于通过遗传修饰编码ABC葡萄糖转运蛋白的基因实现酶促活性的降低，所述修饰选自包含以下，优选由以下组成的组：外源DNA插入基因，缺失至少部分的基因，基因序列中的点突变，特别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鼠李糖脂生成细胞，特征在于其经遗传修饰，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.24 EP 16195195.91.鼠李糖脂生成细胞，特征在于其经遗传修饰，从而与其野生型相比，其ABC葡萄糖转运蛋白的活性降低，以及与其野生型相比，其至少一种非ABC葡萄糖转运蛋白的活性增加。2.权利要求1的细胞，特征在于所述非ABC葡萄糖转运蛋白选自EC2.7.3.9的磷酸烯醇丙酮酸磷酸转移酶系统，半乳糖透性酶，葡萄糖促进剂，肌醇转运蛋白，葡萄糖透性酶以及葡萄糖/半乳糖转运蛋白。3.权利要求1或2的细胞，特征在于所述非ABC葡萄糖转运蛋白选自galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶以及由组分酶I、HPr、酶IIA、酶IIB和酶IIC组成的PTS系统，或者具有这样的多肽序列的酶，其中galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶以及PTS系统的多至25％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或它们的组合修饰，并且其仍具有galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶以及PTS系统的至少10％的酶促活性，所述酶IIA、IIB和IIC可能作为融合蛋白存在。4.前述权利要求中至少一项的细胞，特征在于其选自伯克氏菌属、泰国伯克氏菌(Burkholderiathailandensis)、假单胞菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)、食树脂假单胞菌(Pseudomonasresinovorans)、睾丸酮从毛单胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·图姆，S·沙费尔，C·朔尔施，M·韦塞尔，
申请(专利权)人：赢创德固赛有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE