脂蛋白输出信号及其用途制造技术

本文描述了包含脂蛋白输出信号的多肽，包含脂蛋白输出信号的多肽前体，编码所述多肽或多肽前体的核酸，包含编码所述脂蛋白输出信号和/或多肽或多肽前体的核酸的重组表达载体，以及包含这些载体的5重组宿主细胞。本申请还提供了这些多肽、多肽前体、核酸、重组表达载体和重组宿主细胞的用途。

Lipoprotein Output Signal and Its Application

This paper describes a polypeptide containing a lipoprotein output signal, a polypeptide precursor containing a lipoprotein output signal, a nucleic acid encoding the polypeptide or polypeptide precursor, a recombinant expression vector encoding the lipoprotein output signal and/or a polypeptide or polypeptide precursor, and five recombinant host cells containing these vectors. The application also provides the use of these polypeptides, polypeptide precursors, nucleic acids, recombinant expression vectors and recombinant host cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂蛋白输出信号及其用途
本专利技术处于脂蛋白信号肽领域。更特别地，本专利技术提供了包含这些信号肽的多肽、其用途、编码所述多肽的核酸、包含编码这些肽的核酸序列的核酸构建体以及包含这些核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。
技术介绍
细胞表面展示允许使用细菌、酵母或甚至哺乳动物细胞的表面蛋白作为锚定基序以稳定的方式在细胞表面上表达蛋白质或肽或其片段。这种强大的工具已被用于广泛的生物技术和工业应用，诸如活疫苗或灭活疫苗的开发以在人共生或减毒致病细菌细胞上暴露异源表位从而引发抗原特异性抗体反应、筛选展示的肽库、通过表达表面抗原以在动物中产生多克隆抗体的抗体生产、通过固定化酶进行的全细胞催化、生物传感器开发以及用于去除有害化学物质和重金属的环境生物吸附。在八十年代中期，通过在噬菌体的表面上展示与丝状噬菌体的pIII蛋白融合的肽和小蛋白，乔治·P·史密斯成为开发表面表达系统的第一人。从那时起，已开发了各种噬菌体展示系统以在噬菌体表面上表达外源蛋白。然而，待展示于噬菌体表面上的外源蛋白的大小相当有限。因此，开发了微生物细胞表面展示系统。通过表达目的异源肽或蛋白作为具有多种锚定基序的融合蛋白来进行微生物细胞表面展示，所述锚定基序通常是细胞表面蛋白或其片段(“载体蛋白”)。通常，载体蛋白的使用可以影响细胞生理学。例如，使用外膜(OM)蛋白和细胞附属物的亚基可能导致生长缺陷和细胞被膜完整性的不稳定。另外，成功的载体不应该在异源序列的插入或融合上变得不稳定，并且它应该抵抗周质间隙或培养基中存在的蛋白酶的攻击。已经开发了多种锚定基序，包括OprF、OmpC、OmpX、外膜蛋白S，麦芽蛋白LamB和脂蛋白TraT。虽然已经取得了许多成功的结果，但是使用目前的锚定基序并不总是允许有效展示所有靶蛋白。在细胞表面展示系统中，成功的蛋白质展示高度依赖于锚定基序的选择。因此，非常需要探索和开发新的和改进的细胞表面展示系统，用于表达和展示重组蛋白。专利技术概述本申请专利技术人已经发现一种对表面暴露的脂蛋白具有特异性的新的共有序列基序，所述特异性基序充当脂蛋白输出信号(lipoproteinexportsignal，LES)。包含这样的LES的多肽可以成功地输出并且以高效率和稳定性展示于宿主细胞的细胞表面。因此，本文提供了一种多肽前体，其包含(a)革兰氏阴性细菌的脂蛋白的N-末端信号肽，其包含位于所述信号肽的C-末端的最末端的脂盒(lipobox)基序，其中所述脂盒基序由氨基酸序列L(S/A)(A/G)C(SEQIDNO：230)组成并且可被II型信号肽酶特异性识别；(b)脂蛋白输出信号，其包含根据以下共有序列中的任一个的氨基酸序列：-XJZZ(SEQIDNO：197)，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，条件是当J是A时，X是Q；-BZZUZ(SEQIDNO：198)，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者-XKEOEE(SEQIDNO：200)，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的，并且其中所述脂蛋白输出信号位于直接邻接于所述信号肽的C-末端；(c)多肽，其中所述多肽位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C-末端；以及(d)任选地，蛋白酶切割位点基序，其中所述蛋白酶切割位点基序不同于所述脂盒基序并且位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C-末端以及所述多肽的N-末端；其中所述信号肽、所述脂蛋白输出信号和所述多肽不天然共同存在于多肽序列中。在特定的实施方案中，革兰氏阴性细菌的脂蛋白的所述N-末端信号肽是狗咬二氧化碳嗜纤维菌5(C.canimorsus5)的唾液酸酶(siaC)或粘蛋白酶(MucG)的信号肽。在特别的实施方案中，脂蛋白输出信号选自根据以下的氨基酸序列：SEQIDNO：16至SEQIDNO：20或SEQIDNO：40至47中的任一个；SEQIDNO：1至SEQIDNO：15或SEQIDNO：25至39中的任一个；或SEQIDNO：49至SEQIDNO：51或SEQIDNO：63中的任一个。本文还提供了编码如本文所述的多肽前体的核酸。本文还提供了重组表达载体，其包含如本文所述的核酸、启动子和转录和翻译终止信号，以及任选的选择标记。本文还提供了重组表达载体，其包含(a)编码革兰氏阴性细菌的脂蛋白的信号肽的核酸序列，其中所述信号肽包含位于所述信号肽的C-末端的最末端的脂盒基序，其中所述脂盒基序由氨基酸序列L(S/A)(A/G)C组成并且被II型信号肽酶特异性识别；(b)编码脂蛋白输出信号的核酸序列，所述脂蛋白输出信号具有根据以下共有序列中的任一个的氨基酸序列：-XJZZ，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组；条件是当J是A时，X是Q；-BZZUZ，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者-XKEOEE，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的，并且其中编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸序列直接位于编码所述信号肽的所述核酸序列的下游；(c)任选地，编码蛋白酶切割位点基序的核酸序列，其中所述蛋白酶切割位点基序不同于所述脂盒基序并且位于编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸序列和编码所述信号肽的所述核酸序列的下游；以及(d)多克隆位点，其中所述多克隆位点位于编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸和编码所述信号肽的所述核酸的下游，并且任选地位于所述蛋白酶切割位点基序的下游。在特定的实施方案中，革兰氏阴性细菌的脂蛋白的所述N-末端信号肽是狗咬二氧化碳嗜纤维菌5(C.canimorsus5)的唾液酸酶(siaC)或粘蛋白酶(MucG)的信号肽。在特别的实施方案中，所述脂蛋白输出信号选自根据以下的氨基酸序列：SEQIDNO：16至SEQIDNO：20或SEQIDNO：40至47中的任一个；SEQIDNO：1至SEQIDNO：15或SEQIDNO：25至39中的任一个；或SEQIDNO：49至SEQIDNO：51或SEQIDNO：63中的任一个。本文还提供了包含如本文所述的载体的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是拟杆菌门(Bacteroidetesphylum)的细菌细胞。在特别的实施方案中，所述拟杆菌门的细菌细胞是狗咬二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophagacanimorsus)或约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)。另一个方面涉及脂蛋白输出信号用于在宿主细胞中表面暴露多肽的用途，所述脂蛋白输出信号包含根据以下共有序列中的一个的氨基酸序列：-XJZZ，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组；条件是当J是A时，X是Q；-BZZUZ，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者-XKEOEE，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的并且其中所述脂蛋白输出信号位于直接邻接于来源于革兰氏阴性细菌的脂蛋白的N-末端信号肽的N-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽前体，其包含(a)革兰氏阴性细菌的脂蛋白的N‑末端信号肽，其包含位于所述信号肽的C‑末端的最末端的脂盒基序，其中所述脂盒基序由氨基酸序列L(S/A)(A/G)C组成并且可被II型信号肽酶特异性识别；(b)脂蛋白输出信号，其包含根据以下共有序列中的任一个的氨基酸序列：‑XJZZ，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，条件是当J是A时，X是Q；‑BZZUZ，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者‑XKEOEE，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的，并且其中所述脂蛋白输出信号位于直接邻接于所述信号肽的C‑末端；(c)多肽，其中所述多肽位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C‑末端；以及(d)任选地，蛋白酶切割位点基序，其中所述蛋白酶切割位点基序不同于所述脂盒基序并且位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C‑末端以及所述多肽的N‑末端；其中所述信号肽、所述脂蛋白输出信号和所述多肽不天然共同存在于多肽序列中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.12 EP 16183962.61.一种多肽前体，其包含(a)革兰氏阴性细菌的脂蛋白的N-末端信号肽，其包含位于所述信号肽的C-末端的最末端的脂盒基序，其中所述脂盒基序由氨基酸序列L(S/A)(A/G)C组成并且可被II型信号肽酶特异性识别；(b)脂蛋白输出信号，其包含根据以下共有序列中的任一个的氨基酸序列：-XJZZ，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，条件是当J是A时，X是Q；-BZZUZ，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者-XKEOEE，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的，并且其中所述脂蛋白输出信号位于直接邻接于所述信号肽的C-末端；(c)多肽，其中所述多肽位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C-末端；以及(d)任选地，蛋白酶切割位点基序，其中所述蛋白酶切割位点基序不同于所述脂盒基序并且位于所述信号肽和所述脂蛋白输出信号的C-末端以及所述多肽的N-末端；其中所述信号肽、所述脂蛋白输出信号和所述多肽不天然共同存在于多肽序列中。2.根据权利要求1所述的多肽前体，其中革兰氏阴性细菌的脂蛋白的所述N-末端信号肽是狗咬二氧化碳嗜纤维菌5(C.canimorsus5)的唾液酸酶(siaC)或粘蛋白酶(MucG)的信号肽。3.根据权利要求1或2所述的多肽前体，其中所述脂蛋白输出信号选自根据以下的氨基酸序列-SEQIDNO：16至SEQIDNO：20或SEQIDNO：40至47中的任一个；-SEQIDNO：1至SEQIDNO：15或SEQIDNO：25至39中的任一个；或-SEQIDNO：49至SEQIDNO：51或SEQIDNO：63中的任一个。4.一种核酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的多肽前体。5.一种重组表达载体，其包含根据权利要求4所述的核酸、启动子和转录和翻译终止信号，以及任选的选择标记。6.一种重组表达载体，其包含(a)编码革兰氏阴性细菌的脂蛋白的信号肽的核酸序列，其中所述信号肽包含位于所述信号肽的C-末端的最末端的脂盒基序，其中所述脂盒基序由氨基酸序列L(S/A)(A/G)C组成并且被II型信号肽酶特异性识别；(b)编码脂蛋白输出信号的核酸序列，所述脂蛋白输出信号具有根据以下共有序列中的任一个的氨基酸序列：-XJZZ，其中X可以是任何氨基酸，其中J选自由K和A组成的组，其中Z选自由D和E组成的组；条件是当J是A时，X是Q；-BZZUZ，其中B选自由S和T组成的组，其中Z选自由D和E组成的组，并且其中U选自由D、E和F组成的组；或者-XKEOEE，其中X和O可以是任何氨基酸，优选其中O是V；其中所述脂蛋白输出信号是总体上带负电的，并且其中编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸序列直接位于编码所述信号肽的所述核酸序列的下游；(c)任选地，编码蛋白酶切割位点基序的核酸序列，其中所述蛋白酶切割位点基序不同于所述脂盒基序并且位于编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸序列和编码所述信号肽的所述核酸序列的下游；以及(d)多克隆位点，其中所述多克隆位点位于编码所述脂蛋白输出信号的所述核酸和编码所述信号肽的所述核酸的下游，并且任选地位于所述蛋白酶切割位点基序的下游。7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其中革兰氏阴性细菌的脂蛋白的所述N-末端信号肽是狗咬二氧化碳嗜纤维菌5(C.canimorsu...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克·安德烈·劳贝尔，弗朗切斯科·伦齐，盖伊·理查德·科内利斯，
申请(专利权)人：那慕尔大学，
类型：发明
国别省市：比利时,BE