一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种光响应性多功能化学交联剂，结构如通式I所示：

A Photoresponsive Multifunctional Chemical Crosslinking Agent and Its Preparation Method and Application

The invention discloses a light-responsive multifunctional chemical crosslinking agent with the structure shown in general formula I.

【技术实现步骤摘要】
一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用
本专利技术属于蛋白质及其功能研究
，特别涉及一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用。
技术介绍
蛋白质是基因表达的承载者，直接影响着生物的生命过程。在基因组学中，人们发现对基因的研究并不能满足对生命过程的探究需求，而研究蛋白质，则加深对生命过程的理解有重要的作用。因此，蛋白质组学在后基因时代成为重要的研究对象。近年来，用传统生物学方法对蛋白质组学进行研究，渐渐不能满足科学工作者的需求。随着化学合成工艺的成熟，人们发现化学小分子作为一种新兴的工具，是对传统生物学方法(如蛋白质印记WesternBlot、酶联免疫吸附Elisa等)和生物学研究工具(如冷冻电镜)的重要补充。对蛋白质组学的研究中，蛋白交联、修饰和标记是研究蛋白结构和相互作用的常用技术。其中，通过小分子进行蛋白质交联并利用交联质谱解析逐渐发展成为研究蛋白质结构与相互作用的重要研究方法，其优势较传统生物学方法更为直观。蛋白质交联剂是一类小分子化合物，具有2个或者更多的针对特殊基团(-NH2、-COOH、-HS、-OH等)的反应性末端，可以和2个或者更多的蛋白质分别偶联。70年代时人们普遍使用戊二醛作为蛋白质交联剂连接抗体和指示剂(如酶类)，但其缺点是由于交联基团是随机的，容易形成杂乱的多聚体。最近，RuediAebersold等使用氨基特异性的双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)这一经典的小分子交联剂，对蛋白磷酸酶家族进行交联质谱分析，成功解析了其相互作用网络(Herzog,F.,etal.(2012).Science337(6100):1348-1352.)。这一工作堪称化学交联剂研究蛋白质相互作用的经典。随后，类似的小分子交联剂应运而生，并实现商业化，包括DSS系列物、BS3、DSSO(A.Sinz(2017).AnalBioanalChem409(1):33-44.)等。这些小分子交联剂虽然可以通过引入不同反应活性基团实现异源特异性交联，但是交联过程是不可控的，在处理蛋白样品中会带来很多假阳性的结果，特别是蛋白的自交联，很大程度上限制了其对蛋白相互作用的研究与进一步的应用。光反应由于具有时空可控性被引入小分子交联剂体系中，它可以首先利用不稳定的热反应活性基团与一种蛋白进行交联，然后通过紫外光来交联第二种蛋白，从而避免蛋白自交联的干扰，大大降低了传统化学交联带来的局限性。现有的应用到交联剂上的光响应基团主要有苯叠氮(Tanaka,Y.,etal.(2008).MolBiosyst4(6):473-480.)、二苯甲酮(Majmudar,C.Y.,etal.(2009).JAmChemSoc131(40):14240-14242.)、双吖丙叮(Suchanek,M.,etal.(2005).NatMethods2(4):261-267.)三种，其中很多产品也实现了商业化。但是，这种光响应交联虽然实现了时空的可控性，但是反应机理都是通过自由基C-H或N-H的插入反应，对基团没有选择性，不能明确在蛋白上的反应位点，从而丧失交联的特异性。另外，大部分光响应的交联剂虽然结构简单，但是相应衍生物的制备合成比较困难，使得其价格昂贵。因此，寻找一种新的、易于制备的、具有特异性反应活性的光响应性基团，并将其引入小分子化学交联剂体系，就有望解决现有交联剂的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种光响应性多功能化学交联剂。本专利技术的第二个目的是提供一种所述光响应性多功能化学交联剂的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供一种所述光响应性多功能化学交联剂的用途。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面提供了一种光响应性多功能化学交联剂，结构如通式I所示：其中，R1、R2、R3、R4分别独立地选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基、亚烷基或改性烷基；R’是传统化学反应基团，选自以下结构中的一种：R”选自生物素及其衍生物、烷基烯及其衍生物、烷基炔及其衍生物等可用于磁珠富集技术的基团或氢原子；进一步选自荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、1，8-萘二甲酰亚胺等具有荧光识别功能的基团；特别的，当R”选自氢原子时，光响应性多功能化学交联剂I是光响应双功能交联剂。特别的，当R”选自生物素、烷基烯及其衍生物、烷基炔及其衍生物等可用于磁珠富集技术的基团时，光响应性多功能化学交联剂I是光响应三功能交联剂。其中X与R1、R2、R3、R4中的一个连接，X选自芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基、改性亚烷基、醚键、酯键、碳酸酯键、酰胺键、脲键以及以上所述自由组合。所述芳基为5～10元芳香单环或芳香稠合双环结构；所述杂芳基为环上含有选自O、S、N或Si中的至少一种杂原子的5～10元芳香单环或芳香稠合双环结构；所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和或不饱和脂肪族直链或支链的烷基；所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和或不饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、酯基、芳基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、伯氨基、仲胺基、叔胺基或季铵盐基替代，所述改性烷基具有1～30个原子，其碳碳单键可任意地被碳碳双键或碳碳叁键替换；所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-OH、-SH、-NO2、-CN、-CHO、-COOH、酯基、芳基、-CO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、伯氨基、仲胺基、叔胺基或季铵盐基替代，所述改性亚烷基具有1～30个原子，其碳碳单键可任意地被碳碳双键或碳碳叁键替换；所述醚键选自以下结构中的一种：-O(CH2)x-、-(CH2)xO(CH2)y-、-(CH2CH2O)x、-(CH2CH2O)x(CH2)y-，其中x和y≥0且为整数；所述酯键选自以下结构中的一种：-COO(CH2)x-、-OCO(CH2)x-、-(CH2)xCOO(CH2)y-、-(CH2)xOCO(CH2)y-，其中x和y≥0且为整数；所述碳酸酯键选自以下结构中的一种：-CO3(CH2)x-、-(CH2)xCO3(CH2)y-,其中x和y≥0且为整数；所述酰胺键选自以下结构中的一种：-NHCO(CH2)x-、-CONH(CH2)x-、-(CH2)xNHCO(CH2)y-、-(CH2)xCONH(CH2)y-，其中x和y≥0且为整数；所述脲键选自以下结构中的一种：-NHCONH(CH2)x-、-(CH2)xNHCONH(CH2)y-，其中x和y≥0且为整数；所述烷基烯及其衍生物为具有1～30个碳原子的不饱和脂肪族直链或支链的烷基，在其中非特定位点含有不限定数量的碳碳双键；所述烷基炔及其衍生物为具有1～30个碳原子的不饱和脂肪族直链或支链的烷基，在其中非特定位点含有不限定数量的碳碳三键；所述荧光素及其衍生物为荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、异硫氰酸酯荧光素；所述罗丹明及其衍生物为罗丹明、氨基罗丹明、羧基罗丹明、异硫氰酸酯罗丹明。本专利技术优选的化合物为，光响应性多功能化学交联剂的结构通式为：R’是传统化学反应基团，选自本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光响应性多功能化学交联剂，其特征在于：结构如通式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种光响应性多功能化学交联剂，其特征在于：结构如通式I所示：其中，R1、R2、R3、R4分别独立地选自氢、卤原子、羟基、巯基、胺基、硝基、氰基、醛基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、烷氧基、亚烷基或改性烷基；R’选自以下结构中的一种：R”选自生物素及其衍生物、烷基烯及其衍生物、烷基炔及其衍生物或氢原子；其中X与R1、R2、R3、R4中的一个连接，X选自芳基、杂芳基、烷基、亚烷基、改性烷基、改性亚烷基、醚键、酯键、碳酸酯键、酰胺键、脲键以及以上所述自由组合。2.根据权利要求1所述的光响应性多功能化学交联剂，其特征在于：所述光响应性多功能化学交联剂的结构通式为：R’选自以下结构中的一种：R”为氢原子，X选自以下结构中的一种：其中n1是1～6的整数，n2是1～10的整数，n3是1～4的整数，n4是1～6的整数，n5是0～6的整数；或，R”选自生物素及其衍生物，X为以下结构：其中n是2～6的整数。3.根据权利要求2所述的光响应性多功能化学交联剂，其特征在于：所述光响应性多功能化学交联剂的结构通式为：NBS-1、Sulfo-NBS-1中n是1～6的整数，NBS-2、Sulfo-NBS-2中n是1～10的整数，NBM、Sulfo-NBM中n是0～6的整数，NBNCO中n是1～6的整数，NBPM中n是1～4的整数，Tri-NB中n是2～6的整数。4.根据权利要求3所述的光响应性多功能化学交联剂，其特征在于：所述光响应性多功能化学交联剂的结构为以下结构中的一种：5.一种权利要求1至4任一项所述的光响应性多功能化学交联剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：NBS-1、Sulfo-NBS-1中n是1～6的整数，NBNCO中n是1～6的整数，第一步，将摩尔比为1:(3～5):(1.5～2.5)的化合物4、碳酸钾和N-Boc溴乙胺溶于溶剂中，回流反应，反应结束后，过滤取滤液，旋干除去溶剂，柱层析提纯得到化合物5；第二步，将第一步制备的化合物5溶于溶剂和过量的三氟乙酸的混合溶液中，室温反应，反应结束后旋干除去溶剂，剩余物真空抽干，将抽干后的剩余物溶于溶剂中，缓慢滴加含有双琥珀酰亚胺酯的溶液，双琥珀酰亚胺酯与化合物5的摩尔比为(1～1.5):1，加入催化量的三乙胺，常温反应，反应结束后，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得到化合物NBS-1；或，缓慢滴加含有双琥珀酰亚胺酯磺酸钠的溶液，双琥珀酰亚胺酯磺酸钠与化合物5的摩尔比为(1～1.5):1，加入催化量的三乙胺，常温反应，反应结束后，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得到化合物Sulfo-NBS-1；或，缓慢滴加含有异氰酸酯的溶液，异氰酸酯与化合物5的摩尔比为(1～1.5):1，加入催化量的三乙胺，常温反应，反应结束后，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得到化合物NBNCO；或，NBS-2、Sulfo-NBS-2中n是1～10的整数，第一步，将摩尔比为1:(1.1～3):(1.1～4)的化合物4、溴丁酸甲酯和碳酸钾溶于溶剂中，回流反应，反应结束后，过滤取滤液，旋干除去溶剂，乙醇重结晶，得到化合物6；第二步，将第一步制备的化合物6溶于溶剂中，加入过量的氢氧化钾常温反应，反应结束后，旋干除去溶剂，水溶解，调pH直至4为止，产生黄色沉淀，过滤取滤饼，得到化合物7；第三步，将第二步制备的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)的化合物7、羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂中，常温反应，反应结束后，二氯甲烷和水萃取，取有机相，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得到化合物NBS-2；或，将第二步制备的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)的化合物7、羟基丁二酰亚胺磺酸钠和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于溶剂中，常温反应，反应结束后，二氯甲烷和水萃取，取有机相，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得到化合物Sulfo-NBS-2；NBM、Sulfo-NBM中n是0～6的整数，第一步，将摩尔比为1:(1.1～3):(1.1～4)的化合物4、二溴代烷基和碳酸钾溶于溶剂中，回流反应，反应结束后，过滤取滤液，旋干除去溶剂，柱层析提纯，得化合物10；第二步，将第一步制备的摩尔比为1:(1.1～3):(1.1～4)的化合物10、马来酰亚胺和碳酸钾溶于溶剂中，回流反应，反应结束后，过滤取滤液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：包春燕，汪晨曦，张姝雯，项昌育，林秋宁，朱麟勇，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31