一种细菌性角膜炎动物模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种细菌性角膜炎动物模型及其构建方法和应用，所述构建方法包括以下步骤：S1、麻醉下在实验小鼠的眼球角膜表面划三条平行切口，深度割破角膜上皮层但不超过角膜内皮层，在角膜切口区域滴加1‑10ul携带荧光标记基因的绿脓杆菌悬液，静置后自然复苏；S2、将经步骤S1处理后的实验小鼠每日进行观察角膜感染情况，并检测角膜荧光情况。该构建方法简便，并可成功建立稳定的细菌感染性角膜炎动物模型；且采用携带荧光标记基因的绿脓杆菌感染活体角膜组织，可在生物活体荧光成像系统下实时定量观察角膜感染情况，进而可广泛应用于细菌感染性角膜炎的致病机制、治疗效果评价等多方面的研究。

An animal model of bacterial keratitis and its construction method and Application

The invention provides an animal model of bacterial keratitis and its construction method and application. The construction method comprises the following steps: S1, drawing three parallel incisions on the corneal surface of experimental mice under anesthesia, cutting corneal epithelium but not more than corneal endothelium in depth, dropping 1_10 UL of Pseudomonas aeruginosa suspension carrying fluorescent marker gene into the corneal incision area, and standing for self-treatment. Resuscitation; S2, the experimental mice after treatment were observed daily corneal infection and corneal fluorescence. The method is simple and can successfully establish a stable animal model of bacterial infective keratitis. The living corneal tissue infected by Pseudomonas aeruginosa carrying fluorescent marker gene can be used to observe the corneal infection in real time and quantitatively under the bio-living fluorescence imaging system, which can be widely used in the pathogenesis of bacterial infective keratitis and the evaluation of therapeutic effect. \u3002

【技术实现步骤摘要】
一种细菌性角膜炎动物模型及其构建方法和应用
本专利技术涉及眼科医学模型领域，具体地说，涉及一种细菌性角膜炎动物模型及其构建方法和应用。
技术介绍
细菌性角膜炎是一种致盲性眼病，其危险因素包括眼外伤、角膜接触镜佩戴、眼部手术、干眼症、激素类药物长期使用以及机体免疫功能低下。细菌性角膜炎常见致病菌主要有绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等。细菌性角膜炎需要及时治疗以减轻角膜组织的损害、减少角膜瘢痕形成，进而预防进一步的视力损害。随着抗生素的广泛使用，目前由耐药性细菌感染造成的细菌性角膜炎屡见不鲜，如何有效控制这类角膜炎感染病情是亟待解决的临床问题。因而，构建细菌性角膜炎动物模型，对于细菌性角膜炎相关的基础研究以及未来的临床转化，均具有十分重要的意义。目前常用的感染性角膜炎模型多为损伤性，主要有角膜划痕法、角膜环钻法、基质注射法等，目的是造成角膜基质层损伤，便于细菌自角膜表面侵袭感染。但这些模型最大的不足之处在于，如需检测角膜感染情况，则需要先处死实验动物取出角膜后，才能进行细菌学检测，无法在活体上实时连续监测，不利于角膜炎治疗相关研究的观察分析。因而亟需建立一种可实时监测角膜感染情况的角膜炎动物模型。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种细菌性角膜炎动物模型及其构建方法和应用。该菌性角膜炎动物模型的构建方法简便、高效，并且能在生物活体荧光成像系统下实时定量观察角膜炎情况，进而可广泛应用于细菌感染性角膜炎的致病机制、治疗效果评价等多方面的研究。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种细菌性角膜炎动物模型的构建方法，包括以下步骤：S1、麻醉下在实验小鼠的眼球角膜表面划三条平行切口，深度为割破角膜上皮层但不超过角膜内皮层，在角膜切口区域滴加1～10ul绿脓杆菌悬液，静置后自然复苏；S2、将经步骤S1处理后的实验小鼠每日进行观察角膜感染情况，并检测角膜荧光情况。优选地，步骤S1中，所述实验小鼠为无眼部疾患的雌性健康小鼠；雌性小鼠不易激惹，便于后续多次麻醉成像进行观察。优选地，步骤S1中，所述绿脓杆菌悬液中的细菌量为1×105CFU～1×106CFU。所述细菌量过低不容易造成有效的角膜感染浓度过高容易出现严重感染引起眼内炎而超出角膜感染模型的范畴，因此细菌量浓度过低或过高都不利于控制该动物模型的稳定性。优选地，步骤S1中，所述绿脓杆菌悬液的制备方法如下：将携带荧光标记基因的绿脓杆菌菌株ATCC19660，在脑心浸液肉汤中37℃摇晃孵育过夜，4000rpm离心后，加入PBS溶液重悬即得。优选地，所述脑心浸液肉汤中含有浓度为10～100ug/ml的卡那霉素。优选地，所述步骤S2中，采用生物活体荧光成像系统检测实验小鼠角膜荧光情况，并对荧光图像进行定量分析。本专利技术还提供了一种根据前述方法构建的细菌性角膜炎动物模型。本专利技术还提供了一种细菌性角膜炎动物模型在研究细菌性角膜炎中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、本专利技术的构建方法简便，并可成功建立稳定的细菌感染性角膜炎动物模型；2、采用携带荧光标记基因的绿脓杆菌感染活体角膜组织，可在生物活体荧光成像系统下实时定量观察角膜感染情况。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为实验小鼠绿脓杆菌感染角膜后眼部情况观察照片；其中，D0为接种后即刻拍照；D1为接种后1天；D2为接种后2天；D4为接种后4天；图2为实验小鼠角膜活体荧光成像图；其中，D0为接种后即刻拍照；D1为接种后1天；D2为接种后2天；D4为接种后4天；图3为实验小鼠角膜荧光定量分析图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例提供了一种细菌性角膜炎动物模型制备方法，具体步骤如下：1、动物准备：选用无眼部疾患的雌性健康小鼠，8周龄，体重约18-20g。2、细菌悬液准备：实验所采用的绿脓杆菌(ATCC19660)是带有荧光标记基因的菌株，可通过荧光成像直接观察细菌感染情况。细菌培养液采用含有50ug/ml卡那霉素的脑心浸液肉汤(BHI培养液)。绿脓杆菌在BHI培养液中37℃摇晃孵育过夜，4000rpm离心后，加入PBS溶液重悬，调整细菌悬浮液中细菌含量为108CFU/ml，待用。3、动物手术：小鼠常规腹腔麻醉，仅选用一只眼球为实验用眼。采用30.5G针头在眼球角膜表面划三条平行切口，深度不超过角膜基质层。在角膜切口区域滴加5ul上述绿脓杆菌悬液(含有5*105CFU细菌量)，静置2min。4、手术后处理：小鼠置于加热垫上，待其从麻醉状态复苏后，送回动物房。术后每日观察角膜感染情况，并检测角膜荧光情况。实施例2细菌性角膜炎动物模型观察1、角膜情况观察：每日观察实施例1手术后的实验小鼠角膜情况，并采用数码相机拍照记录(图1)。根据国际通用的角膜评分表(表1)对实验小鼠角膜情况进行评分，接种后即刻角膜评分0；接种后1天角膜评分1；接种后2天角膜评分2-3；接种后4天角膜评分3-4。表1：实验小鼠角膜病理改变评分表2、角膜活体荧光成像：采用生物活体荧光成像系统(HamamatsuPhotonicsKK,Bridgewater,NJ,USA)检测实验小鼠角膜荧光情况(图2)，带有荧光的细菌显著成像，无细菌区域显示为常规灰度图像，并进一步对荧光图像进行定量分析(图3)，细菌接种后第2天至第7天，荧光信号显示温度高表达，接种7天后眼球组织出现穿孔或萎缩等组织坏死情况，从而导致细菌营养不良、死亡，引起荧光信号逐渐下降。结果：1)小鼠角膜在接种绿脓杆菌后24小时，角膜出现较明显不透明区，覆盖瞳孔区；接种后48小时，可见大部分角膜呈现不透明；接种后96小时，可见全部角膜呈现不透明，表现出明显角膜炎特征。2)角膜活体荧光成像显示，在接种绿脓杆菌后即刻，角膜即呈现荧光；接种24小时后，角膜区域荧光明显增强，且角膜强荧光可维持到接种后96小时。综上所述，本专利技术的细菌性角膜炎动物模型构建方法简便、高效，并且能在生物活体荧光成像系统下实时定量观察角膜炎情况，进而可广泛应用于细菌感染性角膜炎的致病机制、治疗效果评价等多方面的研究。以上对本专利技术的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本专利技术并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本专利技术的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌性角膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在实验小鼠的眼球角膜表面划三条平行切口，深度为割破角膜上皮层但不超过角膜内皮层，在角膜切口区域滴加1～10ul绿脓杆菌悬液，静置后自然复苏；S2、将经步骤S1处理后的实验小鼠每日进行观察角膜感染情况，并检测角膜荧光情况。

【技术特征摘要】
1.一种细菌性角膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在实验小鼠的眼球角膜表面划三条平行切口，深度为割破角膜上皮层但不超过角膜内皮层，在角膜切口区域滴加1～10ul绿脓杆菌悬液，静置后自然复苏；S2、将经步骤S1处理后的实验小鼠每日进行观察角膜感染情况，并检测角膜荧光情况。2.根据权利要求1所述的细菌性角膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述实验小鼠为无眼部疾患的雌性健康小鼠。3.根据权利要求1所述的细菌性角膜炎动物模型的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述绿脓杆菌悬液中的细菌量为1×105CFU～1×106CFU。4.根据权利要求1或3所述的细菌性角膜炎动物模型的构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓东，朱鸿，黄海清，胡洁，汪枫桦，闫泉，翟元琦，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31