一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物蛋白分子技术领域，特别是指一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用。所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；采集动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液，制备抗体血清；通过亲和层析纯化抗体血清，得到红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体。本发明专利技术通过合成红麻COX3多克隆抗体，检测红麻COX3蛋白在红麻不同细胞质中表达差异，以明确COX3对红麻花药发育的重要影响。

A Kind of Antigen Polypeptide of Kenaf Mitochondrial Protein COX3 and the Method and Application of Preparing Polyclonal Antibody

The invention relates to the field of biological protein molecular technology, in particular to a kenaf mitochondrial protein COX3 antigen polypeptide and a method for preparing polyclonal antibody and its application. The amino acid sequence of the antigen polypeptide is shown as SEQ ID NO:2. Antigen polypeptide was coupled with carrier protein KLH to obtain polypeptide-KLH conjugated complex protein; after fully emulsified with equal volume Freund's complete adjuvant, immunized animals; collected animal serum, when titer reached 1:20000 or more, collected animal blood by carotid artery bloodletting to prepare antibody serum; purified antibody serum by affinity chromatography, obtained more than COX3 of Kenaf mitochondrial protein. Clonal antibody. By synthesizing polyclonal antibody against kenaf COX3, the present invention detects the difference of expression of Kenaf COX3 protein in different cytoplasm of kenaf, so as to clarify the important influence of COX3 on anther development of kenaf.

【技术实现步骤摘要】
一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用
本专利技术涉及生物蛋白分子
，特别是指一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽制备多克隆抗体的方法和应用。
技术介绍
完整的线粒体基因转录本是研究植物线粒体基因表达的重要基础。CR-RT-PCR是研究基因转录起始位点和终止位点以及线粒体基因转录本5’和3’转录剪切方式的重要方法(KuhnandBinder,2002;张丹丹,2016)。5’端存在多个转录起始位点是植物线粒体基因的普遍特征。Kuhn等在12个拟南芥线粒体基因中共发现30个转录起始位点，其中9个线粒体基因含多个转录起始位点，但3’末端只有一个终止位点(Kuhnetal.,2005;Forneretal.,2007)；水稻HL-CMS的atp6-orfH79的5’端有2个转录起始位点，同时水稻线粒体基因atp1，atp6和atp9转录本的5’也存在多个转录位点，而3’端只有一个终止位点(Wangetal.,2013;Kazamaetal.,2013)，红麻线粒体基因atp1、atp4和cox3转录本的3’也只有一个转录终止位点，但转录本的5’端存在多个转录起始位点，说明植物mRNA5’端的不一致性与线粒体基因的翻译有关，并受到核基因的调控(Kazamaetal.,2008;Koizukaetal.,2003)。RNA加工因子RPF2具有三角五肽状重复序列特征是高等植物线粒体5’mRNA所必需的，RPF2参与线粒体基因nad9和cox3mRNA5’端的形成(Jonietzetal.,2010)。atp9转录本5’转录起始位点在两种胞质中一致，而不育系3’转录终止位点比保持系短126bp，这与甜菜不育胞质和可育胞质rps3转录本5’转录起始位点相同，但不育胞质的3’转录终止末端比可育胞质缺少460bp的研究结果一致(Matsunagaetal.,2011)，表明线粒体基因的转录调控存在多样性。高等植物线粒体细胞色素c基因主要包含cox1，cox2和cox3，这些基因的正常发挥对植物花粉育性具有重要作用(Liuetal.,2011)。甜菜CMS-G中COX1蛋白表达量低于保持系，同时cox2突变后C端产生的一个短截分子降低了细胞色素c氧化酶的活性(Meyeretal.,2018)。短截的线粒体基因atp4f，cox1f和rps3f转化烟草导致烟草雄性不育，使线粒体呼吸活性改变会导致花粉败育。线粒体复合体酶呼吸活力检测和蛋白图谱表明在atp4f,cox1f和rps3f转基因植株中复合体I发生改变(Shayaetal.,2012)。甜菜CMS-G两个突变基因：nad9亚基C-端延伸，而cox2亚基C-末端短截，导致了细胞色素c氧化酶活性降低50%，表明甜菜CMS与呼吸链酶活性的改变密切相关(Ducosetal.,2001)。但是红麻细胞色素氧化酶相关基因是否与红麻CMS存在必然关系相关，本专利技术基于前期cox3转录本在不育系和保持存在差异的研究基础，用Westernblot技术检测COX3在红麻UG93A、UG93B和F1（UG93A/UG93R）表达差异，探究COX3是否与参与红麻CMS核质互作调控。
技术实现思路
本专利技术提出一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽及制备多克隆抗体的方法和应用，解决了研究线粒体COX3基因在红麻不同细胞质质中的表达差异中的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种红麻COX3蛋白抗体抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。利用抗原多肽制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的方法，步骤如下：（1）将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；（2）将多肽‐KLH偶联复合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；（3）采集经步骤（2）处理的动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液，制备抗体血清；（4）通过亲和层析纯化步骤（3）得到的抗体血清，完成红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的制备。所述步骤（1）中偶联采用的偶联剂为MBS。制备的红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的应用，所述红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体作为COX3蛋白功能研究和检测红麻线粒体蛋白COX3在红麻不同材料中的表达差异的应用。本专利技术的有益效果在于：（1）红麻细胞质雄性不育（CytoplasmicMaleSterility,CMS）与能量代谢缺陷密切相关，ATP是能量代谢最密切的化合物。COX3做为线粒体电子传递链复合体V亚基蛋白，在ATP合成过程中发挥重要作用，因此COX3蛋白功能是否正常发挥，对红麻线粒体能量代谢和花粉发育具有重要影响。COX3是一个含6次跨膜结构域的疏水蛋白，导致其蛋白锚定在线粒体膜上，这一结构特征对研究红麻线粒体COX3蛋白功能产生很大难题。（2）本专利技术根据COX3蛋白N端有一段非跨膜结构域，利用多肽‐KLH偶联方法制备COX3蛋白抗体，该抗体能够准确检测红麻内源COX3蛋白表达，而且灵敏度高，特异性强，所杂交蛋白产物无任何背景和杂带，说明该抗体能够稳定用于红麻COX3蛋白功能研究。（3）本申请专利技术人在检测COX3蛋白抗体特异性时，以植物β-Actin蛋白为内参，采用红麻不育系UG93A、保持系UG93B和杂交种F1（UG93A/UG93R）为材料检测COX3在不同胞质的表达差异。发现内参蛋白β-Actin在三种不同胞质中稳定表达，而COX3蛋白在不育系UG93A的表达量低于保持系UG93B和杂交种F1。暗示着COX3可能通过蛋白互作方式参与红麻花药发育的能量代谢调控，并与红麻CMS密切相关。本专利技术为阐明红麻CMS分子机理提供技术方法和理论基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为COX3蛋白跨膜结构的分析图。图2为红麻不同胞质COX3抗体的免疫检测对比图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。红麻COX3蛋白抗体制备的流程主要包括以下几个方面：(一)红麻COX3蛋白序列分析和多肽设计与合成根据GenBank（登录号：MF163174中红麻cox3的gDNA序列设计特异引物扩增cox3的CDS区序列，经ORFfinder分析得出COX3蛋白序列含280个氨基酸残基，通过ExPASY在线软件（https://web.expasy.org/protparam/）得知其是分子量大小为31.60kDa，等电点为6.72的中性蛋白。用TMHMMServerv.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/#opennewwindow）分析COX3的二级结构，表明COX3是一个含6次跨膜结构的疏水性蛋白（图1）。进一步分析该蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽，其特征在于：所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种红麻线粒体蛋白COX3抗原多肽，其特征在于：所述抗原多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.利用权利要求1所述的抗原多肽制备红麻线粒体蛋白COX3多克隆抗体的方法，其特征在于，步骤如下：（1）将抗原多肽与载体蛋白KLH偶联，得到多肽‐KLH偶联复合蛋白；（2）将多肽‐KLH偶联复合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后，免疫动物；（3）采集经步骤（2）处理的动物的血清，当效价达到1:20000以上采用颈动脉放血方式收集动物血液...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖小芳，赵艳红，孔祥军，周瑞阳，周步进，侯文焕，唐兴富，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45