错配耐受的环介导等温扩增方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种错配耐受的环介导等温扩增方法及应用。本发明专利技术的方法对于扩增反应的反应体系进行了优化，特别是DNA聚合酶的选用。本发明专利技术的方法可良好地应用于基于环介导等温扩增的检测，与传统方法相比，简便、快速、灵敏、准确，具有更高的检出率和更短的检测时间。

Ring-mediated Isothermal Amplification of Mismatch Tolerance and Its Application

The present invention relates to a mismatch tolerant RING-mediated isothermal amplification method and its application. The method of the invention optimizes the reaction system of the amplification reaction, especially the selection of DNA polymerase. The method of the invention can be well applied to the detection based on loop-mediated isothermal amplification. Compared with the traditional method, the method is simple, fast, sensitive and accurate, and has higher detection rate and shorter detection time.

【技术实现步骤摘要】
错配耐受的环介导等温扩增方法及应用
本专利技术属于核酸检测
，更具体地说，本专利技术涉及用于检测多种病原体的错配耐受的环介导等温扩增(LAMP)检测方法及应用，本专利技术还涉及基于该方法设计的病原体检测试剂盒。
技术介绍
传染病病原检测是新发突发传染病防控的关键，快速准确的诊断对于预防、治疗和控制尤其关键。特别是新发突发疫情发生时候，现场快速的床边诊断技术尤为关键。点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，进行相关的检测的准确性常常难以保证。现有技术中对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多态性(Single-StrandConformationalPolymorphism，SSCP)技术、异源双链分析(hereroduplexanalysis，HA)技术、变性高效液相色谱法(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC)、变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)、化学错配裂解法(chemicalmismatchcleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技术、质谱法(massspectrometry)、DNA芯片(DNAchip)技术、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、等位基因特异性PCR(allelespecificPCR，ASPCR)、分子信标(molecularbeacons)技术等等。这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性有待提高。当前，绝大部分的新发突发传染病由病毒引起。病毒检测有多种方法，包括病毒培养、电子显微镜观察、病毒抗原抗体检测。虽然病毒培养是检测的金标准，但是过程复杂，耗时数天。电子显微镜通过观察病毒的形态来进行科属判定，但是对技术人员要求高，且价格昂贵。病毒抗原抗体检测是检测病毒感染后产生的蛋白来鉴定病原体，还需要根据病人临床症状来判定。核酸检测是一种新型的检测方法，它通过PCR等手段检测病毒感染过程中所产生的核酸，不仅检测时间较早，且耗时较短。目前，实时荧光定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)是较为常用的一种检测方法，分为染料法和探针法。核酸检测是当前最常用的病毒检测方法。然而，上述检测方法均需要在实验室开展，不能实现现场检测。因此，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确地检测高变异的病毒等病原体的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供简便、快速、灵敏、准确地检测高变异的病毒等病原体的环介导的恒温扩增(LAMP)方法。在本专利技术的第一方面，提供一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。在一个优选例中，所述方法包括以下步骤：在一扩增体系中，以待测核酸样品为模板，以M种引物对进行扩增，当引物与模板存在错配时(特别是引物3’端)，高保真DNA聚合酶识别并切除引物3’端错配碱基；其中，M为≥1的正整数。在另一优选例中，所述的M种引物对包括位点特异性引物对；包括：第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应。在另一优选例中，M为1～50的正整数，如为2、3、4、5、8、10、15、20、30、40。在另一优选例中，所述的M种引物对中≥80％，≥90％或100％是位点特异性引物对。在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：Q5DNA聚合酶、KODplusneoDNA聚合酶、SupertaqDNA聚合酶、HiFiTaqDNA聚合酶、BlendTaqDNA聚合酶、PromstarHSDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、KODFXDNA聚合酶或其组合。在另一优选例中，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，其选自下组：大片段BstDNA聚合酶、全长BstDNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、或其组合。在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶的量为0.002～0.026U每微升反应体积；较佳的为0.004～0.018U每微升反应体积；更佳的为0.006～0.016U每微升反应体积。在另一优选例中，所述的链置换DNA聚合酶的量为0.08～0.48U每微升反应体积；较佳的为0.16～0.4U每微升反应体积；更佳的为0.24～0.32U每微升反应体积。在另一优选例中，所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。在另一优选例中，所述环介导等温扩增的反应温度为50～70℃；较佳的为58～68℃；更佳的为62～65℃。在另一优选例中，所述环介导等温扩增的反应时间为10～120分钟；较佳的为30～90分钟；更佳的为45～60分钟。在另一优选例中，所述环介导等温扩增的仪器包括选自下组的仪器：温控水浴锅，金属浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪，荧光恒温扩增仪。在另一优选例中，通过荧光法、比色法或浊度法进行扩增产物的分析和检测；较佳地，加入双链DNA结合荧光染料或者酸碱及离子显色染料，从而实现结果的荧光实时检测，或紫外光下的荧光显色或常见光下的比色反应(颜色变化)。在另一优选例中，所述的双链DNA结合荧光染料指游离染料不发生荧光信号，当结合到双链DNA中后，可以激发产生荧光信号的染料。在另一优选例中，所述的酸碱显色染料指在酸碱pH发生改变的时候，染料颜色发生相应的改变，比如从酸性到中性到碱性，或者从碱性到中性到酸性，染料颜色发生改变。在另一优选例中，所述双链DNA结合染料包括选自下组的染料：SYBRGreenI，SYTO9。在另一优选例中，所述酸碱指示染料包括选自下组的染料：钙黄绿素，羟基萘酚蓝(HNB)，中性红，甲酚红，甲酚紫，苯酚红。在另一优选例中，所述的待测样品是含有病原体核酸的样品，较佳地是含有高变异性病原体核酸的样品，所述的高变异性病原体如病毒。在另一优选例中，所述的病原体为一种或多种病原体，所述多种病原体为1-100种，如10、20、30、50种。在另一优选例中，所述的病原体包括同一种类病毒的不同病毒亚型或株。在另一优选例中，所述的待测核酸样品包括但不限于来自：植物、动物、细胞或细胞培养物、组织、体液、食品、饲料、土壤、淡水、海水、地下水。在另一优选例中，所述的对待测核酸样品进行序列检测的方法是非疾病诊断性的检测方法。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括：所述的特异性扩增引物、Mg2+、dNTPs、Tris-HCl、NH4+、K+、TritonX-20。在本专利技术的另一方面，提供一种用于错配耐受的环介导恒温扩增的检测试剂盒，所述试剂盒中包括：用于进行环介导等温扩增的特异性扩增引物；较佳地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。

【技术特征摘要】
1.一种错配耐受的环介导恒温扩增方法，其特征在于，所述方法包括：以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶的混合酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在一扩增体系中，以待测核酸样品为模板，以M种引物对进行扩增，当引物与模板存在错配时，高保真DNA聚合酶识别并切除引物3’端错配碱基；其中，M为≥1的正整数；所述的M种引物对包括位点特异性引物对；包括：第一引物对FIP和BIP：为内引物，用于构建LAMP反应的环结构；第二引物对F3和B3：为外引物，用于置换内引物进而促进成环；第三引物对FL和BL：为环引物，用于加速LAMP反应。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶是具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的高保真DNA聚合酶选自下组：Q5DNA聚合酶、SupertaqDNA聚合酶、HiFiTaqDNA聚合酶、KODplusneoDNA聚合酶、BlendTaqDNA聚合酶、PromstarHSDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、KODFXDNA聚合酶或其组合。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶是不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；较佳地，所述的链置换DNA聚合酶选自下组：大片段BstDNA聚合酶、全长BstDNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst3.0DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、或其组合。5.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶的量为0.002～0.026U每微升反应体积；较佳的为0.004～0.018U每微升反应体积；更佳的为0.006～0.016U每微升反应体积。6.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述的链置换DNA聚合酶的量为0.08～0.48U每微升反应体积；较佳的为0.16～0.4U每微升反应体积；更佳的为0.24～0.32U每微升反应体积。7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的高保真DNA聚合酶与链置换DNA聚合酶的比例按照酶活性单位比例为1:10～1:160；较佳地1:15～1:80；更佳地1:20～1:60。8.如权利要求1或2所述的方法，所述环介导等温扩增的反应温度为50～70℃；较佳的为58～68℃；更佳的为62～65℃；和/或所述环介导等温扩增的反应时间为10～120分钟；较佳的为30～90分钟；更佳的为45～60分钟；和/或所述环介导等温扩增的仪器包括选自下组的仪器：温控水浴锅，金属浴锅，PCR仪，荧光定量PCR仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：张驰宇，周毅，李莹雪，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31