一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测乳中单增李斯特菌活菌的方法，属于食品安全技术领域。该方法是向受检乳中加入PMA，然后置于暗处孵育，接着卤素灯曝光；加入柠檬酸钠和氢氧化钠，经离心，弃上清，洗涤等一系列操作后，提取DNA；以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；利用琼脂糖凝胶电泳法观察条带的有无对LAMP扩增产物进行鉴定，即完成检测。本发明专利技术方法耗时较短，检测灵敏度高，可以显著减少原料乳加工前和成品出厂前待检结果的储藏时间。对液体乳中单增李斯特菌活菌的检出限为6.37×10

A Method for Rapid Detection of Liszt Mononuclear in Milk

The invention discloses a method for rapid detection of Listeria monocytogenes in milk, which belongs to the technical field of food safety. The method is to add PMA to the tested milk, then incubate it in the dark, then expose the halogen lamp, add sodium citrate and sodium hydroxide, centrifugation, distill the supernatant, wash and wait for a series of operations, extract the DNA, extract the template as LAMP to amplify the LAMP, get the LAMP expansion and increase the yield, use agarose gel electrophoresis to observe the presence of the strip and identify the LAMP amplification product. Complete the test. The method of the invention has the advantages of short time-consuming and high detection sensitivity, and can significantly reduce the storage time of the results to be inspected before raw milk processing and before products leaving the factory. Limit of detection of Listeria monocytogenes in liquid milk was 6.37 x 10

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法
本专利技术涉及一种检测单增李斯特菌活菌的方法，属于食品安全

技术介绍
单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，简称单增李斯特菌，属李斯特菌属，是重要的食源性致病菌之一，分布广泛，生存环境可塑性大，新生儿、孕妇、40岁以上的成人和免疫功能缺陷者易被感染，食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李氏杆菌病”，这种病能引起新生儿脑膜炎、败血症等疾患，致死率达30％以上。WHO已将其列为食品中四大致病菌之一，因此，单增李斯特菌的污染防控和检测方法一直是公众和研究者关注的热点之一，是许多国家食品中微生物检测的必检指标之一。然而传统的培养法检测单增李斯特菌费时费力，免疫学方法容易交叉感染。随着分子技术的不断发展，单增李斯特菌的检测已经进入到核酸水平，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，简称LAMP)发展迅速，其针对目的基因的六个区域设计4条特异性引物(两条外引物和两条内引物)，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下，1h内即可实现核酸的高效扩增，LAMP技术具有标志性的特征，是其他技术不能比拟的，它操作简单，快速省时，特异性强，灵敏度高，无需特殊设备，鉴定简便，已广泛用于单增李斯特菌的检测。但是LAMP方法会同时扩增样品中的死菌和活菌的DNA，不能有效区分死菌和活菌，易造成高估实际样品中存在的活菌水平。这就会给食品检测带来威胁，并会限制LMAP技术的发展。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌、传统的液体乳中致病菌检测方法存在检测时间长，检测成本高的问题，提供一种PMA-LAMP快速检乳中单增李斯特菌活菌的方法。本专利技术快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，包括如下步骤：(1)待检乳样的前处理：向待检乳中加入PMA，然后置于暗处进行预孵育，接着置于650W卤素灯下照射，然后曝光一定时间；本步骤操作均在冰浴上进行；(2)样品DNA的提取：向步骤(1)处理后的待检乳中加入柠檬酸钠和氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀；(3)用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到提取物；(4)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；(5)鉴定：取5μLLAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中含有单增李斯特活菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中不含有单增李斯特活菌。进一步地，步骤(1)是向1mL待检乳中加入终浓度为50μM～200μM的PMA，然后置于暗处放置5min～10min，接着置于距650W卤素灯20cm处照射，曝光5min～9min。更进一步地，所述的PMA的终浓度为50μM。该条件为有效的最小剂量。更进一步地，所述的置于暗处放置时间为5min。该条件为有效的最短孵育时间。更进一步地，所述的曝光时间为5min。该条件为有效的最短曝光时间。进一步地，步骤(2)中柠檬酸钠和氢氧化钠的浓度为别为250g/L和1mol/L。进一步地，步骤(4)中LAMP扩增的反应体系为25μL，其中：外引物浓度和内引物浓度比为1/4～1/10，10×Buffer2.5μL，10mM的dNTPs4μL，终浓度为4mM～8mM的MgSO4，终浓度为0mol/L～2mol/L的甜菜碱，200U/μL的Bst2.0DNA酶1μL，模板DNA2μL，ddH20加至25μL。更进一步地，所述的外引物浓度和内引物浓度比为1/8。该条件下效果最好。更进一步地，所述的MgSO4的终浓度为4mM。该条件下效果最好。更进一步地，所述的甜菜碱的终浓度为1mol/L。该条件下效果最好。更进一步地，LAMP反应体系具体由下列成分组成：LAMP扩增条件为：63℃1h，80℃2min终止反应。本专利技术有益效果：本专利技术利用灵敏极高的LAMP技术与PMA染料相结合，解决了LAMP方法不能有效区分死/活菌的缺点，避免假阳性问题，同时提高了单增李斯特菌检测的灵敏度。本专利技术把单增李斯特菌的hlyA基因做为目的基因，以活菌的DNA作为检测模板。建立了一个PMA与LAMP相结合的新方法(简称PMA-LAMP方法)，实现了快速、灵敏、有效地检测乳中单增李斯特活菌，为食品中单增李斯特菌的检测开辟了一个新思路。附图说明图1为外引物和内引物的不同比例对LAMP反应的影响；(M：DNAMarker；1：阴性对照；2～5：外引物与内引物浓度比分别为1/4、l/6、l/8、1/10)。图2为不同镁离子浓度对LAMP反应的影响；(M：DNAMarker；1：阴性对照；2～6：镁离子浓度分别为2、4、6、8、10mM)。图3为甜菜碱对LAMP反应的影响；(M：DNAMarker；1：阴性对照；2～5：甜菜碱浓度分别为0、0.8、1、1.5、2mol/L)。图4为孵育时间的确定；(M：DNAMarker；1：空白对照；2：不加PMA处理；3～8为PMA处理，孵育时间分别为：3、4、5、6、7、10min)。图5为曝光时间的确定；(M：DNAMarker；1：空白对照；2：不加PMA处理；3～7为PMA处理，曝光时间分别为：1、3、5、7、9min)。图6为不同PMA浓度对死菌的影响；(M：DNAMarker；1：不加PMA处理；2～9：PMA的浓度分别为：20、30、40、50、60、70、80、90μM)图7为PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立；(M：DNAMarker；1：未经PMA处理的活菌；2：PMA处理的活菌；3：未经PMA处理的死菌；4：PMA处理的死菌)。图8为PMA-LAMP检测纯培养的单增李斯特活菌的灵敏度；(M：DNAMarker；1：阴性对照(死菌)；2～10：活菌浓度分别为4.9×107、4.9×106、4.9×105、4.9×104、4.9×103、4.9×102、4.9×101、4.9×100、4.9×10-1CFU/mL)。图9为PMA-LAMP检测人工污染乳中单增李斯特活菌的灵敏度；(M：DNAmarker；1：阴性对照；2～10：人工污染乳中单增李斯特活菌浓度分别为：6.37×107、6.37×106、6.37×105、6.37×104、6.37×103、6.37×102、6.37×101、6.37×100、6.37×10-1CFU/mL)。图10为PMA-PCR检测人工污染乳中单增李斯特活菌的灵敏度；(M：DNAmarker；1：阴性对照；2～10：人工污染乳中单增李斯特活菌浓度分别为：6.37×107、6.37×106、6.37×105、6.37×104、6.37×103、6.37×102、6.37×101、6.37×100、6.37×10-1CFU/mL)。图11为LAMP引物特异性的检测结果；(M：DNAmaerker；1：阴性对照；2～11：菌株分别为英诺克本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)待检乳样的前处理：向待检乳中加入PMA，然后置于暗处进行预孵育，接着置于650W卤素灯下照射曝光；本步骤操作均在冰浴上进行；(2)样品DNA的提取：向步骤(1)处理后的待检乳中加入柠檬酸钠和氢氧化钠，然后离心，弃上清，得沉淀；(3)用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后离心，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到提取物；(4)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；(5)鉴定：取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测；若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中含有单增李斯特活菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中不含有单增李斯特活菌。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)待检乳样的前处理：向待检乳中加入PMA，然后置于暗处进行预孵育，接着置于650W卤素灯下照射曝光；本步骤操作均在冰浴上进行；(2)样品DNA的提取：向步骤(1)处理后的待检乳中加入柠檬酸钠和氢氧化钠，然后离心，弃上清，得沉淀；(3)用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后离心，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到提取物；(4)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；(5)鉴定：取LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测；若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中含有单增李斯特活菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中不含有单增李斯特活菌。2.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，其特征在于步骤(1)中PMA的终浓度为50μM～200μM。3.根据权利要求1所述的一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：付世骞，冯晓涵，张紫薇，姜毓君，满朝新，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23