一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，涉及寄生虫扩增检测技术领域，根据线虫O.sinensis的靶序列ITS建立了LAMP反应体系，在线虫O.sinensis成虫和感染该线虫的扬子鳄粪样中扩增到了特异性产物，检测到成虫基因组DNA的敏感性为3.46pg/μL，是PCR法检测敏感性的10倍，本方法无需昂贵仪器，仅需一个水浴锅，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在64℃条件下，保温1h，即可完成核酸扩增反应，反应后加入核酸染料即可观察结果，且与其它寄生虫未出现交叉反应，缩短了现场检测时间，有利于在基层卫生机构、床边检测和流行病学调查等领域推广使用。

A Ring-mediated Isothermal Amplification and Detection Method for Alligator sinensis

The invention discloses a RING-mediated isothermal amplification and detection method for Chinese alligator nematode, which relates to the technical field of parasite amplification and detection. A LAMP reaction system is established according to the target sequence ITS of nematode O.sinensis. Specific products are amplified from adult O.sinensis and feces of Chinese alligator infected with the nematode. The sensitivity of detecting adult genomic DNA is 3.46 pg/muL, which is a PCR method for detection. The sensitivity of this method is 10 times higher than that of other parasites. The method needs only a water bath pot and uses the Bst DNA polymerase with chain displacement activity to complete the nucleic acid amplification reaction at 64 C for 1 hour. After the reaction, the nucleic acid dye can be added to observe the results, and there is no cross reaction with other parasites, which shortens the on-site detection time and is conducive to grass-roots health institutions and beds. Edge detection and epidemiological investigation are widely used.

【技术实现步骤摘要】
一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法
本专利技术涉及寄生虫扩增检测
，特别是指一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法。
技术介绍
寄生虫病的诊断在经历了普通病原学、免疫学诊断后，近年来随着分子生物学诊断技术的不断提高，以目标DNA序列为检测对象的核酸检测法已能准确地对寄生虫做出诊断和检测。其中，尤以PCR技术发展最快，同时，以PCR为基础的实时定量PCR、多重PCR、巢式PCR等将这一技术发展到更高的水平。但是，由于核酸的检测过程往往需要昂贵的仪器设备、专业的技能型人才、复杂的操作过程、冗长的试验周期等，不能适应基层及现场的快速检测需求，限制了相关技术的推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种快速、简单、灵敏、特异且成本低的非PCR核酸扩增方法。当前，LAMP已经广泛应用于医疗卫生、食品安全、胚胎鉴定、动植物检验检疫、转基因产品等多个领域的病毒、微生物、寄生虫等病原体的分子检测。Ortleppascarissinensis是寄生于扬子鳄胃肠道内的一种蛔目线虫，能对扬子鳄胃肠壁造成一定损伤，也是扬子鳄肠道内的优势寄生虫。蛔目线虫在扬子鳄肠道内大量繁殖将导致扬子鳄因消化道内寄生大量蛔虫而出现食欲不振、体格消瘦，甚至大量死亡。由于扬子鳄是我国特有的珍稀野生动物，也是世界上现存23种鳄中最濒危的物种之一，不可能采取定期剖杀来检查肠道内寄生线虫情况，且传统的粪样形态学检测操作复杂、容易漏检，分子检测又需要专业的仪器才能进行。因此，开发出一种对扬子鳄蛔目线虫Ortleppascarissinensis的检测方法是目前急于解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，以解决现有技术中全部或者部分不足。基于上述目的本专利技术提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，包括如下步骤：1)线虫O.sinensis基因克隆：采用上下游引物对线虫O.sinensis基因的内转录间隔区ITS进行PCR扩增，PCR产物纯化后，连接到载体pMD19-T上，然后转化至大肠杆菌中表达，筛选阳性克隆进行测序鉴定，得克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列，其中，上下游引物序列分别为：NC5：5`-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3`；NC2：5`-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3`；2)LAMP(环介导等温扩增)引物设计：将克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列分为六个独立的区域，采用引物软件分别设计LAMP反应所需的6条引物，其中，包括外引物，F3：5`-GCAGACACATTGAGCACT-3`；B3：5`-GGAGCTCGATAACGAAAGC-3`；内引物，FIP：5`-ACGACCCTCAGCCAGACGTGAAGACTTTGAACGCGCATTG-3`；BIP：5`-GGCGTCATCGCGTTGATACGTCTGAGCGTAGTATCCTGAA-3`；环引物，LB：5`-AACGGGAAAGAACCCGAT-3`；LF：5`-CGTGCTATCAGAAATGCAAGT-3`；3)LAMP反应：根据设计的6条LAMP引物，以线虫O.sinensis基因组DNA质粒为模板，进行LAMP反应；4)LAMP反应结果检测：分别采用TVR显色法和浊度法来检测结果。可选的，所述(1)的PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，46℃～56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃终延伸10min。可选的，所述(1)中PCR产物纯化采用1％琼脂糖电泳和DNA胶回收试剂盒纯化。可选的，所述(1)中PCR反应总体积为25μL，含2.5μL10×Buffer、2.0μL的2.5mol/LMgCl2、4.0μL的2.5mM/LeachdNTPs、10μmol/L上下游引物各0.5μL、100ng模板基因组DNA和0.25μL的5U/μLTaqDNA聚合酶，加无菌水补足。可选的，所述(3)LAMP反应的体系25μL：pH8.8，20mMTris-HCl、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％Tween20、0.8Mbetaine、8mMMgSO4、1.4mMeachdNTP、8UBstDNApolymerase、40pmolFIP和BIP，5pmolF3和B3，20pmolLB和LF。可选的，所述(3)LAMP反应的温度为60～67℃，时长55～65min。可选的，所述(3)LAMP反应结束前需要在80℃灭活10min。一种LAMP检测扬子鳄线虫的方法，将收集的阳性粪样冻存灭活虫卵，然后提取线虫O.sinensisDNA，测定O.sinensis质粒DNA的浓度，然后做10倍比梯度稀释，进行所述LAMP反应，分别采用所述TVR显色法和浊度法来检测结果。可选的，所述冻存的温度为零下75～85℃。从上面所述可以看出，本专利技术提供的一种扬子鳄线虫环介导等温扩增及检测方法，根据线虫O.sinensis的靶序列ITS建立了LAMP反应体系，在线虫O.sinensis成虫和感染该线虫的扬子鳄粪样中扩增到了特异性产物，检测到成虫基因组DNA的敏感性为3.46pg/μL，是PCR法检测敏感性的10倍，并且与人蛔虫、裂头绦虫、大片吸虫、日本血吸虫、旋毛虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、异尖线虫、Cucullanuselongatus均未出现交叉反应，在临床上，可从感染线虫O.sinensis的扬子鳄粪样中扩增出特异性DNA。本方法无需昂贵仪器，仅需一个水浴锅，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在64℃条件下，保温1h，即可完成核酸扩增反应，反应后加入核酸染料即可观察结果，且与其它寄生虫未出现交叉反应，缩短了现场检测时间，有利于在基层卫生机构、床边检测和流行病学调查等领域推广使用。附图说明图1为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应引物实时浊度仪结果示意图；图2为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应温度实时浊度仪结果示意图；图3为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应敏感性实时浊度仪检测结果示意图；图4为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应敏感性TVR染料检测结果示意图；图5为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应敏感性PCR检测结果示意图；图6为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应特异性实时浊度仪检测结果示意图；图7为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应特异性TVR染料检测结果示意图；图8为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应特异性PCR检测结果示意图；图9为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应粪样实时浊度仪检测结果示意图；图10为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应粪样TVR染料检测结果示意图；图11为本专利技术实施例基于ITS基因的线虫O.sinensisLAMP反应粪样PCR检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：1)线虫O.sinensis基因克隆：采用上下游引物对线虫O.sinensis基因的内转录间隔区ITS进行PCR扩增，PCR产物纯化后，连接到载体pMD19‑T上，然后转化至大肠杆菌中表达，筛选阳性克隆进行测序鉴定，得克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列，其中，上下游引物序列分别为：NC5：5`‑GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT‑3`；NC2：5`‑TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT‑3`；2)LAMP(环介导等温扩增)引物设计：将克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列分为六个独立的区域，采用引物软件分别设计LAMP反应所需的6条引物，其中，包括外引物，F3：5`‑GCAGACACATTGAGCACT‑3`；B3：5`‑GGAGCTCGATAACGAAAGC‑3`；内引物，FIP：5`‑ACGACCCTCAGCCAGACGTGAAGACTTTGAACGCGCATTG‑3`；BIP：5`‑GGCGTCATCGCGTTGATACGTCTGAGCGTAGTATCCTGAA‑3`；环引物，LB：5`‑AACGGGAAAGAACCCGAT‑3`；LF：5`‑CGTGCTATCAGAAATGCAAGT‑3`；3)LAMP反应：根据设计的6条LAMP引物，以线虫O.sinensis基因组DNA质粒为模板，进行LAMP反应；4)LAMP反应结果检测：分别采用TVR显色法和浊度法来检测结果。...

【技术特征摘要】
1.一种扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：1)线虫O.sinensis基因克隆：采用上下游引物对线虫O.sinensis基因的内转录间隔区ITS进行PCR扩增，PCR产物纯化后，连接到载体pMD19-T上，然后转化至大肠杆菌中表达，筛选阳性克隆进行测序鉴定，得克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列，其中，上下游引物序列分别为：NC5：5`-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3`；NC2：5`-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3`；2)LAMP(环介导等温扩增)引物设计：将克隆扩增的线虫O.sinensisITS序列分为六个独立的区域，采用引物软件分别设计LAMP反应所需的6条引物，其中，包括外引物，F3：5`-GCAGACACATTGAGCACT-3`；B3：5`-GGAGCTCGATAACGAAAGC-3`；内引物，FIP：5`-ACGACCCTCAGCCAGACGTGAAGACTTTGAACGCGCATTG-3`；BIP：5`-GGCGTCATCGCGTTGATACGTCTGAGCGTAGTATCCTGAA-3`；环引物，LB：5`-AACGGGAAAGAACCCGAT-3`；LF：5`-CGTGCTATCAGAAATGCAAGT-3`；3)LAMP反应：根据设计的6条LAMP引物，以线虫O.sinensis基因组DNA质粒为模板，进行LAMP反应；4)LAMP反应结果检测：分别采用TVR显色法和浊度法来检测结果。2.根据权利要求1所述的扬子鳄线虫环介导等温扩增方法，其特征在于，所述(1)的PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，46℃～56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃终延...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵金红，谷生丽，李媛媛，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：安徽,34