微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用技术

本发明专利技术提供了通过微生物发酵生产谷内酯的方法、谷内酯生产工程菌及应用。所述通过微生物发酵生产谷内酯的方法包括利用谷内酯生产菌由甾醇发酵生产谷内酯，其特征在于，所述谷内酯生产菌具有至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶，该酶能够催化以下化合物I至II的反应i，并且所述方法包括抑制所述谷内酯生产菌中的至少一种所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量，所述反应为：

Method, Engineering Bacteria and Application of Microbial Fermentation to Produce Glutenolactone

The invention provides a method for producing glutenolactone by microbial fermentation, an engineering bacteria for producing glutenolactone and its application. The method for producing glutaractone by microbial fermentation includes the fermentation of glutaractone producing bacteria to produce glutaractone by sterol. The characteristics of the method include that the glutaractone producing bacteria has at least one fatty acid coenzyme A/carboxylate reductase, which can catalyze the reaction I of compounds I to II, and the method includes inhibiting at least one of the fatty acids in the glutaractone producing bacteria. The activity and/or expression level of coenzyme A/carboxylate reductase are as follows:

【技术实现步骤摘要】
微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用
本专利技术属于微生物发酵领域，具体而言，涉及微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用。
技术介绍
甾体(也称为甾醇)是一类具有环戊烷多氢菲环结构的化合物，通常在C-10和C-13位有甲基基团，在C-17位有烷基侧链，其结构式如下式III所示。甾体作为一种细胞膜的组分，在生物体中具有重要的作用。一些甾体还具有激素和信号分子的作用。自上世纪50年代发现甾体药物以来，到目前为止已经鉴定了300多种甾体药物。甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等，甾体激素药物已成为仅次于抗生素的第二大类药物。根据《甾体化学进展》(周维善、庄治平主编，科学出版社2002年出版，ISBN7-03-009607-X)报道，很多微生物包括诺卡氏菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)、节杆菌(Arthrobocter)、和假单胞杆菌(Pseudomonas)等都可将甾体母核环戊烷多氢菲及侧链全部氧化成二氧化碳和水。甾体的代谢途径经Sih及其合作工作者(参考文献“SihCJ,TaiHH,TsongYY,LeeSS,CoombeRG.Mechanismsofsteroidoxidationbymicroorganisms.XIV.Pathwayofcholesterolside-chaindegradation.Biochemistry.1968；7:808-18.”、“SihCJ,TaiHH,TsongYY.Themechanismofmicrobialconversionofcholesterolinto17-ketosteroids.JAmChemSoc.1967；89:1957-8.”和“SihCJ,WangKC,TaiHH.Mechanismsofsteroidoxidationbymicroorganisms.XIII.C22acidintermediatesinthedegradationofthecholesterolsidechain.Biochemistry.1968；7:796-807.”)的研究阐述如图1所示。该过程表明，在微生物降解过程中可通过控制不同酶的活力，获得如4AD(化合物15)、ADD(化合物16)、9-OH-AD和谷内酯(化合物24)等重要的中间体。又据微生物研究中广泛使用的《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’smanualofsystematicbacteriology)，红球菌(Rhodococcus)与分枝杆菌和诺卡氏菌具有许多相同的特征，曾被分类为分枝杆菌属。2012年，在红球菌中发现了与分枝杆菌类似的甾醇降解基因簇(参见文献“MohnWW,WilbrinkMH,CasabonI,StewartGR,LiuJ,vanderGeizeR,etal.GeneclusterencodingcholatecatabolisminRhodococcusspp.JBacteriol.2012；194:6712-9”)，因此可以认为，红球菌具有与图1描述的一致的甾醇代谢途径。谷内酯((4aR,6aS,9aS,9bS)-6a-甲基八氢环戊二烯并[f]色烯-3,7(2H,8H)-二酮)是甾体代谢途径的重要中间体，现有技术通过传统的诱变育种获得了谷内酯生产菌种，从而可发酵生产谷内酯。例如，Nakamatsu等利用珊瑚色诺卡氏菌(Nocardiacoralline)IFO3338突变株制备了谷内酯，但摩尔产率只有25％(参考文献“NakamatsuR,BeppuT,ArimaK.Microbialdegradationofsteroidstohexahydroindanonederivatives.AgricBiolChem.1980,44:1469-74”)；Ferreira等利用RhodococcusaustralisCSIR-236.457突变株制备谷内酯，摩尔产率达60％，当底物浓度在6-12g/L时，摩尔产率约为63％(参考文献“FerreiraNP,RobsonPM,BullJR,vanderWaltEW.Themicrobialproductionof3aα-H-4α-(3’-propionicacid)-5α-hydroxy-7aβ-methylhexahydro-indan-l-one-δ-lectonefromcholesterol.BiotechnLetters.1984,6:517-22.”)。然而，这些现有的谷内酯发酵生产菌种所达到的摩尔产率仍然较低，并且副产物多，导致分离纯化困难、生产成本高，这导致相关甾体药物的价格高。
技术实现思路
为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了微生物发酵生产谷内酯的方法、工程菌及应用。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种通过微生物发酵生产谷内酯的方法，包括利用谷内酯生产菌由甾醇发酵生产谷内酯，其特征在于，所述谷内酯生产菌具有至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶，该酶能够催化以下化合物I至II的反应i，并且所述方法包括抑制所述谷内酯生产菌中的至少一种所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量，所述反应为：其中，“—X”为羟基或羰基；“—Y”为羟基或“—SCoA”。(2)根据(1)所述的方法，其中所述谷内酯生产菌包括放线菌(Actinomycetales)和假单胞菌(Pseudomonas)；优选地，所述放线菌包括红球菌(Rhodococcus)、诺卡式菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(streptomyces)和节杆菌(Arthrobacter)。(3)根据(1)所述的方法，其中所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2、4、13或14所示。(4)根据(1)所述的方法，其中所述抑制通过基因敲除或基因突变来实现。(5)根据(1)所述的方法，其中所述发酵生产在25-45℃、7-8的pH下进行3-12天。(6)一种谷内酯生产工程菌，其特征在于，所述谷内酯生产工程菌中的至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量被抑制，其中所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶能够催化以下化合物I至II的反应i：其中，“—X”为羟基或羰基；“—Y”为羟基或“—SCoA”。(7)根据(6)所述的谷内酯生产工程菌，其中所述谷内酯生产菌包括放线菌(Actinomycetales)和假单胞菌(Pseudomonas)；优选地，所述放线菌包括红球菌(Rhodococcus)、诺卡式菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(streptomyces)和节杆菌(Arthrobacter)。(8)根据(6)所述的谷内酯生产工程菌，其中所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2、4、13或14所示。(9)根据(8)所述的谷内酯生产工程菌，其中所述抑制是通过基因敲除或基因突变来实现的。(10)根据(6)-(9)中任一项所述的谷内酯生产工程菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过微生物发酵生产谷内酯的方法，包括利用谷内酯生产菌由甾醇发酵生产谷内酯，其特征在于，所述谷内酯生产菌具有至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶，该酶能够催化以下化合物I至II的反应i，并且所述方法包括抑制所述谷内酯生产菌中的至少一种所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量，所述反应为：

【技术特征摘要】
1.一种通过微生物发酵生产谷内酯的方法，包括利用谷内酯生产菌由甾醇发酵生产谷内酯，其特征在于，所述谷内酯生产菌具有至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶，该酶能够催化以下化合物I至II的反应i，并且所述方法包括抑制所述谷内酯生产菌中的至少一种所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量，所述反应为：其中，“—X”为羟基或羰基；“—Y”为羟基或“—SCoA”。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述谷内酯生产菌包括放线菌(Actinomycetales)和假单胞菌(Pseudomonas)；优选地，所述放线菌包括红球菌(Rhodococcus)、诺卡式菌(Nocardia)、分枝杆菌(Mycobacterium)、链霉菌(streptomyces)和节杆菌(Arthrobacter)。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2、4、13或14所示。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制通过基因敲除或基因突变来实现。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵生产在25-45℃、7-8的pH下进行3-12天。6.一种谷内酯生产工程菌，其特征在于，所述谷内酯生产工程菌中的至少一种脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶的活性和/或表达量被抑制，其中所述脂肪酸辅酶A/羧酸还原酶能够催化以下化合物I至...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯进辉，陈曦，姚培圆，刘娜，张瑞，李雪梅，吴洽庆，朱敦明，马延和，张峥斌，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12