人类耳祖细胞鉴定和分离制造技术

本发明专利技术主要涉及人耳祖细胞的鉴定和分离。更具体地，本发明专利技术涉及使用细胞标志物从混合细胞群中鉴定和分离人耳祖细胞的方法、富集和产生人耳祖细胞的方法以及用于鉴定和/或分离人耳祖细胞的相关试剂盒，其中细胞标志物选自SSEA1(CD15)、二唾液酸神经节苷脂GD3、TRA‑2‑49(肝/骨/肾碱性磷酸酶)、SSEA4、神经节苷脂GD2和CD141。

Identification and isolation of human ear progenitor cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人类耳祖细胞鉴定和分离本专利技术主要涉及人耳祖细胞的鉴定和分离。更具体地，本专利技术涉及使用细胞标志物从混合细胞群中鉴定和分离人耳祖细胞的方法、富集和产生人耳祖细胞的方法以及用于鉴定和/或分离的相关试剂盒。耳聋是一种在世界范围内具有高发病率的病症，主要由感觉毛细胞及其相关螺旋神经节神经元(SGN)的丧失产生。在所有耳聋形式中，听神经病变尤其令人担忧。这种病况主要由SGN的损伤引起，毛细胞相对保留，这种病况是造成大部分听力损伤患者的原因。尽管可以通过人工耳蜗部分地克服毛细胞的丧失，但是没有常规治疗可用于感觉神经元丧失，因为差的神经支配限制了植入物的预期性能。使用干细胞来恢复受损的感觉回路是一种潜在的治疗策略。已经开发了使用参与初始规范耳基板的信号(例如FGF3和FGF10)来诱导从人胚胎干细胞(hESC)分化的方案(Chen等人2012.RestorationofauditoryevokedresponsesbyhumanES-cell-derivedoticprogenitors.Nature,490(7419):278-82.doi:10.1038/nature11415)。所诱导的耳祖细胞能够在体外分化成毛细胞样细胞和显示预期电生理特性的听觉神经元。此外，当移植到听神经病模型中时，耳神经祖细胞植入、分化并显著改善听觉诱发的反应阈值。然而，所使用的FGF3/10诱导方法效率低，仅产生约20％的所需细胞类型。如果来源于人胚胎干细胞(hESC)的耳祖细胞用于临床环境，则必须从分化过程中无意中产生的其他细胞类型中分离这些细胞。从异质培养物中分离出组分细胞群的既定方法是荧光激活细胞分选(FACS)，但是为了使用该方法，必须鉴定出与关键细胞类型(例如耳祖细胞)结合的特异性细胞表面标志物。尽管已经描述了多种标志物来分离一般神经祖细胞，但尚未鉴定出分离人耳祖细胞(神经或上皮细胞)的标志物。本专利技术的一个目的是提供一种从混合细胞群中鉴定和可能地分离人耳祖细胞的方法。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其使用至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1(也被称为CD15或Lewisx)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141。根据本专利技术的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141。根据本专利技术的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141，其中被鉴定为具有以下的细胞被鉴定为人耳祖细胞：a)SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4或GD2中的至少两种；或者b)SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2中的至少一种，而无CD141。根据本专利技术的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其使用至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1(也被称为CD15)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141，所述方法包括：-提供对至少两种不同细胞标志物(即至少两种选自以下的不同细胞标志物：SSEA1(也被称为CD15)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141)特异的结合成员；-将混合细胞群与结合成员接触；和-检测结合成员与混合细胞群中的细胞的结合或非结合。根据本专利技术的另一方面，提供了一种从混合细胞群中富集人耳祖细胞的方法，所述方法包括：-根据本专利技术鉴定人耳祖细胞；和-分选细胞，使得人耳祖细胞从非耳祖细胞中分离出来，使人耳祖细胞在群中富集。根据本专利技术的另一方面，提供了一种产生人耳祖细胞群的方法，所述方法包括：-将非耳祖细胞分化为人耳祖细胞，由此一些非耳祖细胞可能保留在群中形成混合细胞群；以及-根据本专利技术的方法从混合细胞群中富集人耳祖细胞。根据本专利技术的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含至少两种不同结合成员，其中结合成员被布置成与选自SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141的不同细胞标志物结合。根据本专利技术的另一方面，提供了CD141作为阴性细胞标志物以鉴定混合细胞群中的非耳祖细胞的用途。有利地，细胞标志物SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141已经通过使用一组细胞表面抗体在两种不同的人胚胎干细胞系(使用两种不同的方法分化成耳祖细胞)上进行多轮筛选而鉴定。使用客观的、定量的表达阈值和耳祖细胞形态的定性、形态学分析，选择了标记正确细胞类型的以下标志物。此外，CD141被鉴定为阴性标志物，即其标记不是耳祖细胞的细胞。已经使用可以用于流式细胞术和荧光自动细胞分选(FACS)的抗体表征了人多能干细胞衍生的耳祖细胞的细胞表面蛋白质组，以便从分化多能干细胞产生的异源群中纯化它们。分离和纯化可以a)通过更好地定义恰当的细胞类型和去除潜在的危险细胞，来改善用于细胞治疗的直接应用，和b)通过去除可能具有混杂效应的细胞来改进药物筛选和毒性的体外测定。此外，这些标志物对于纯化耳祖细胞非常有用，以便：1)使它们进一步分化为感觉毛细胞或神经元。这应该使得分化方案更有效，促进制备的扩大用于高通量药物筛选；和2)为细胞移植治疗选择恰当的细胞类型，尽量减少不需要的细胞类型的污染，并降低治疗产生副作用的潜在风险。附图说明图1—通过用FGF3和FGF10诱导FGF信号传导实现hES细胞向耳祖细胞结局的诱导。通过在前9天加入WNT-失活，随后进行WNT-活化3天同时降低FGF3和FGF10浓度，已经实现了祖细胞产量的提高。图2—由单个细胞的荧光强度(板1数据)产生的点图，x轴上来自内源性报告物的GFP水平和y轴上来自二级靶向细胞表面标志物抗体的Alexa568。图3—合并的GD3(红)、PAX2(绿)和Hoechst(蓝)图像。箭头表示：耳神经元祖细胞的PAX2+/GD3-集落形态，耳上皮祖细胞的PAX2+/GD3+集落和PAX2-/GD3+细胞，基于形态学其被预测为非耳祖细胞。图4a—突出显示的孔不会被视为潜在命中(hit)，即低于阈值。图4b—突出显示的孔不会被视为潜在命中，即高于阈值。图4c—对应于孔F-3的抗体仅与已用IWR-1和BIO处理的H14s9细胞系结合。由于对这两种细胞系和方案都不常见，因此不再将其视为候选者。图5—在BDLyoplate筛选中检测到的所选标志物的百分比。SSEA1呈现了两次(作为HI98抗体—标记为CD15，和作为MC480抗体—标记为SSEA1)。GD3和TRA-2-49/6E未在BDLyoplates中显示，仅选自我们的初始小组。图6—13周龄人耳蜗导管的切片，对CD141染色。CD141阳性细胞(箭头)位于含有耳祖细胞(箭头)的上皮细胞外。图7—8周龄耳蜗导管的切片，显示对CD141和神经丝(NF200)染色。CD141标记围绕耳蜗上皮细胞的细胞，但不包括NF200阳性成神经细胞(NF200染色切片中的箭头，CD141染色切片中的箭头)。图8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA‑2‑49、SSEA4、GD2和CD141。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.15 GB 1615714.11.一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141。2.根据权利要求1所述的方法，其中细胞标志物SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4和GD2是阳性细胞标志物。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中细胞标志物CD141是阴性细胞标志物。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中组合使用至少两种阳性细胞标志物以鉴定人耳祖细胞。5.根据权利要求2或3所述的方法，其中组合使用至少三种、四种或五种阳性细胞标志物以鉴定人耳祖细胞。6.根据任意前述权利要求所述的方法，其中一种阳性细胞标志物，或至少两种阳性细胞标志物与阴性细胞标志物CD141组合使用。7.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述混合细胞群由体外多能干细胞分化方案提供或在其期间提供，所述体外多能干细胞例如人胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(iPSC)；或者其中所述混合细胞群由去分化、反式分化或直接重编程成人耳细胞谱系提供或在其期间提供；或者其中所述混合细胞群由组织提供，所述组织例如发育中的胎儿内耳组织，或从成人内耳的外科手术干预获得的耳蜗或前庭样品。8.根据任意前述权利要求所述的方法，其中人耳祖细胞的鉴定在体内进行。9.根据任意前述权利要求所述的方法，其中使所述混合细胞群与一个或多个被布置成与细胞标志物结合的结合成员接触。10.根据权利要求9所述的方法，其中结合成员包括抗体、抗体片段或其模拟物。11.根据任意前述权利要求所述的方法，其包括检测步骤，其中检测所述细胞标志物是否存在于细胞或细胞群上。12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述结合成员带有标记用于鉴定。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述标记包含荧光团。14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中检测包括使用FACS和/或使用MACS。15.一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其使用至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141，所述方法包括：-提供对至少两种不同细胞标志物特异的结合成员；-将混合细胞群与结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡洛斯·马塞洛·尼古拉斯·里沃尔塔，萨拉·路易丝·博迪，
申请(专利权)人：谢菲尔德大学，
类型：发明
国别省市：英国,GB