一种伪狂犬病病毒的间接ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种伪狂犬病病毒的间接ELISA检测试剂盒。包括抗原重组蛋白的制备、间接ELISA方法的建立、判定标准和临床血清学应用。所述的抗原重组蛋白的制备方法为，人工合成如SEQ ID NO:2所示的序列，构建质粒表达载体，在大肠杆菌中进行原核表达，最终用镍柱亲和纯化获得。该试剂盒用于检测伪狂犬病病毒抗体，对伪狂犬病病毒2001年以后的流行病毒具有更准确的检测效果，其准确性具体表现为，其检验结果与基于流行毒株的微量血清抗体中和试验具有更好的符合率，因此更符合临床实际的抗体保护力水平。

An Indirect ELISA Kit for Detecting Pseudorabies Virus

The invention discloses an indirect ELISA detection kit for pseudorabies virus. It includes preparation of recombinant antigen protein, establishment of indirect ELISA method, criteria for determination and clinical serological application. The preparation method of the antigen recombinant protein is as follows: the sequence shown in SEQ ID NO:2 is synthesized artificially, the plasmid expression vector is constructed, expressed in E. coli in prokaryotic form, and finally obtained by affinity purification with nickel column. The kit is used to detect the antibody of pseudorabies virus. It has a more accurate detection effect for the epidemic virus after 2001. The accuracy of the kit is manifested in that the test results are in better agreement with the neutralization test of the micro-serum antibody based on the epidemic strain, so it is more in line with the actual level of antibody protection in clinical practice.

【技术实现步骤摘要】
一种伪狂犬病病毒的间接ELISA检测试剂盒
本专利技术属于兽医生物
，涉及一种伪狂犬病病毒的间接ELISA检测试剂盒。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种烈性传染病，主要引起母猪流产、死胎，仔猪出现神经症状，对养猪业危害极大。多年以来，我国采用的PR疫苗主要基于疫苗株Batha-K61制备，并取得较好的效果。然而2011年以来，在我国北方多个省份相继暴发猪伪狂犬病，继而向全国蔓延，其流行特征为Batha-K61等经典疫苗株不能提供足够的保护，并且致死率高。我国学者研究认为，猪伪狂犬病病毒的流行是由于病毒的变异造成。交叉中和试验表明，2011年以来的流行毒株的免疫原性与之前的经典毒株已经有了一定的差异。基因测序结果表明，与经典毒株相比，病毒在gB、gC、gD和gE等多个关键基因都发生了特征性的重大变异。由于流行毒株的变异，不仅急需更换与之相匹配的疫苗，而且需要建立与之相匹配的检测技术，一则用于新疫苗的抗体监控和免疫评价，二则用于建立与变异株疫苗相匹配的免疫程序，以适应针对当前流行毒株的防控需要。酶联免疫吸附试验(ELISA)是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，其用于检测特异性抗体，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。该技术在猪伪狂犬病的防控中发挥了重要的作用。其中针对gB蛋白的抗体ELISA检测，是猪伪狂犬病抗体监测和免疫效果评价的最重要和最常用的方法。研究发现，2011年以来的猪伪狂犬病病毒，与经典的Batha-K61等传统疫苗株相比，基因发生了重大的变异，gB蛋白N端表位发生了总共17个氨基酸的替换和缺失。由于市售gB-ELISA试剂盒都是根据传统毒株建立的，gB重要抗原表位的变异，已影响到试剂盒的检测准确性。在2011年以来的临床实践中，许多用gB-ELISA试剂盒检测阳性率较高，免疫评价较好的养猪场，在变异株病毒到来时仍然会造成大面积感染。抗体监控和免疫评价是伪狂犬病防控中的重要环节，没有准确的检测方法就难以建立良好的免疫程序，也难以保证免疫效果。由于当前流行的猪伪狂犬病病毒gB基因N端抗原表位的重大变异，当前ELISA检测试剂盒已不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。
技术实现思路
由于伪狂犬病病毒2001年出现的变异，病毒gB重要抗原表位已经发生变化，当前ELISA试剂盒的检测结果已经不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。为了解决上述技术问题，本专利技术建立一种检测PRV抗体的间接ELISA试剂盒。本专利技术的目的在于提供一种伪狂犬病病毒的间接ELISA试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：SEQIDNO:1所示氨基酸序列在制备伪狂犬病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。SEQIDNO:2所示核酸序列在制备伪狂犬病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。一种伪狂犬病毒的间接ELISA检测试剂盒，其组成包括：重组蛋白包被抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、酶标二抗、显色液及终止液和洗涤液；所述重组蛋白包被抗原中含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列。优选的，所述封闭液为含脱脂奶的PBST溶液，脱脂奶浓度为3g/100mL～5g/100mL。优选的，所述酶标二抗为HRP标记的羊抗猪IgG。优选的，所述显色液为TMB底物液；所述终止液为：1.2mol/L～2mol/L硫酸。优选的，所述洗涤液为PBST缓冲液。优选的，阳性对照血清为C株(属于2011年以后流行的伪狂犬病病毒变异毒株)疫苗免疫猪获得的高免血清。优选的，阴性血清为未感染伪狂犬病病毒且未经免疫的猪的血清。一种伪狂犬病毒的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：(1)包被：用碳酸缓冲盐溶液稀释重组蛋白包被抗原，将重组蛋白包被抗原稀释为0.90mg/L，每孔加入80～120μL，3～7℃包被20～18h后甩干，用PBST洗涤；所述重组蛋白包被抗原中含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列；(2)封闭：每孔加入封闭液，36～38℃封闭1.5～2.5h后甩干，用PBS洗涤；(3)待测血清作用条件：待测血清用稀释液稀释后，每孔加入80～120μL，36～38℃孵育0.8～1.2h后甩干，用PBST洗涤；(4)二抗作用条件：将HRP标记的羊抗猪IgG用PBST稀释后，每孔加入80～120μL，36～38℃孵育0.8～1.2h后甩干，用PBST洗涤；(5)显色：每孔加入显色液，36～38℃孵育8～12min后加终止液终止反应；(6)读数：用酶标仪在450mn下读取OD数据，计算结果，根据结果判定样品中是否含有伪狂犬病毒。优选的，所述封闭液为含脱脂奶的PBST溶液，脱脂奶浓度为3g/100mL～5g/100mL；所述酶标二抗为HRP标记的羊抗猪IgG；所述显色液为TMB底物液；所述终止液为：1.2mol/L～2mol/L硫酸。优选的，所述稀释液含4.8～5.2％脱脂奶和4.8～5.2％大肠杆菌裂解稀释液的PBST。优选的，根据结果判定样品中是否含有伪狂犬病毒的标准如下：S/P值判定结果计算公式如下：样品OD值＝检测孔OD值-对照孔OD值临界OD值＝阴性血清平均OD值+3×标准差样品S/P值＝样品OD值/参考阳性血清OD值临界S/P值＝临界OD值/参考阳性血清OD值间接ELISA结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值<0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值<0.2，表明试验成立，样品临界S/P值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P<0.3判定为阴性。本专利技术的有益效果是：由于伪狂犬病病毒2001年出现的变异，病毒gB重要抗原表位已经发生变化，当前ELISA试剂盒的检测结果已经不能准确反映猪群对流行病毒的真实保护力。本专利技术建立了一种检测PRV抗体的间接ELISA试剂盒，对伪狂犬病病毒2001年以后的流行病毒具有更准确的检测效果，其准确性具体表现为，其检验结果与基于流行毒株的微量血清抗体中和试验具有更好的符合率，因此更符合临床实际的抗体保护力水平。附图说明图1是重组蛋白His-BY在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达的SDS-PAGE(左)和Westernblot(右)分析图；其中，左边为SDS-PAGE分析图，第1泳道为蛋白分子量标准，由下至上分别为15kD、25kD、35kD、45kD、55kD、70kD条带；第2泳道为重组菌BL21(DE3)(pET32a-gBN)诱导表达产物，在35kD和45kD之间表达出重组蛋白；第3泳道为重组菌BL21(DE3)(pET32a)诱导表达产物；第4泳道为未经诱导的重组菌BL21(DE3)(pET32a-gBN)。右边为相应的Westernblot图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1包被抗原的制备(1)重组表达载体质粒pET32a-gBBY的构建人工合成如SEQIDNO:2所示的序列，插入pET32a表达载体，构建重组表达载体质粒pET32a-gBBY，委托公司对插入位点两端测序，确定插入成功。SEQIDNO:2所示的序列为：GCAGCAGCACGCGGTGCAGTTGCACTGGCACTGCTGCTGCTGGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID NO:1所示氨基酸序列在制备伪狂犬病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO:1所示氨基酸序列在制备伪狂犬病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。2.SEQIDNO:2所示核酸序列在制备伪狂犬病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。3.一种伪狂犬病毒的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：重组蛋白包被抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、封闭液、酶标二抗、显色液及终止液和洗涤液；所述重组蛋白包被抗原中含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含脱脂奶的PBST溶液，脱脂奶浓度为3g/100mL～5g/100mL。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记的羊抗猪IgG。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB底物液；所述终止液为：1.2mol/L～2mol/L硫酸。7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST缓冲液。8.一种伪狂犬病毒的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)包被：用碳酸缓冲盐溶液稀释重组蛋白包被抗原，将重组蛋白包被抗原稀释为0.90mg/L，每孔加入80～120μL，3～7℃包被2...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄元，向华，王晓虎，陈晶，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44