一种表达高特异性β环糊精糖基转移酶的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达高特异性β环糊精糖基转移酶的基因工程菌及其构建方法和应用，涉及一种基因工程菌。本发明专利技术的基因工程菌是以质粒cgt/pET‑22b为模板，经定点突变后得到突变体A47S、A47M、A47Y、A47R，并于宿主菌E.Coli BL21中转化得到的E.coli BL21(DE3)/A47S、E.coli BL21(DE3)/A47M、E.coli BL21(DE3)/A47Y、E.coli BL21(DE3)/A47R，本发明专利技术的工程菌有效提高了来源于Bacillus cereus的β‑CGTase酶的产物特异性，为其更好的应用于β‑环糊精的工业化生产提供了一定的基础。

A Genetically Engineered Bacterium Expressing High Specificity Beta-Cyclodextrin Glycosyltransferase and Its Construction Method and Application

The invention discloses a genetically engineered bacterium expressing highly specific beta cyclodextrin glycosyltransferase, a construction method and application thereof, and relates to a genetically engineered bacterium. The genetic engineering bacteria of the invention is based on plasmid cgt/pET 22b as template, mutant A47S, A47M, A47Y, A47Y, A47R were obtained after site mutation, mutant A47S, A47S, A47R were obtained after site mutation, and transformed into host bacteria E.Coli BL21 21, E.coli BL21(DE3)/A47S, E.coli BL21(DE3)/A47M/A47M, E.coli BL21(DE3)/A47M, E.coli BL21(DE3)/A473)/A47M, E.coli BL21(DE3)/A47Y, A47Y, E.coli BL21(DE3)/CGTase enzyme The product specificity provides a basis for its better application in the industrial production of beta cyclodextrin.

【技术实现步骤摘要】
一种表达高特异性β环糊精糖基转移酶的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种基因工程菌，尤其涉及一种表达高特异性β环糊精的葡萄糖糖基转移酶基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
环糊精(CDs)是由6至超过100个葡萄糖单元组成的环状葡聚糖，常见的有α-、β-、γ-CD(对应的葡萄糖基单元数目分别为6、7、8)。CDs含有独特的疏水空腔，可与疏水性小分子形成包合物。这种独特的性质使CDs能够与许多难溶性药物形成水溶性包合复合物，增强药物的水溶性，并改善药物的稳定性及生物利用度，是理想的药物辅料，被应用于水性肠胃外溶液、鼻喷雾剂和滴眼液等35种药物产品中。CDs在食品、农业和化妆品等领域也有广泛的应用。环糊精糖基转移酶(CGTase)(EC2.4.1.19)属于糖基水解酶的α-淀粉酶家族(13家族)，是催化淀粉或其他多糖中α-1,4键裂解成CDs的细胞胞外酶。CGTase可以催化四种反应：环化(直链淀粉或支链淀粉中的α-糖苷键裂解，部分产物形成CDs)；偶联(CDs的环状结构中α-糖苷键裂解，将所得的寡糖向转移至受体底物)；歧化(直链低聚糖的α-糖苷键断链，产生的葡萄糖糖基转移到受体底物，生成聚合度不同的糖基化产物)和水解(水分子作为受体，催化底物水解，形成低聚糖)。其中，环化反应产生CDs是CGTase的特征反应，即CGTase催化淀粉的α-糖苷键裂解，部分产物作为糖基受体形成CDs。而偶联反应和环化反应互为逆反应。环化、耦合、歧化是转糖基作用，活性较高，工业生产中主要是利用CGTase的转糖基作用；水解作用的活性通常较低，并且控制CGTase的水解活性将有利于环糊精的生产。CGTase酶法催化淀粉形成CDs，产物通常是α-、β-、γ-CD的混合物，这对CDs的后续分离和纯化产生不利影响。为了提高CGTase的产物特异性，主要有两种有效的策略，向反应体系中添加有机溶剂或者使用定点诱变来改变CGTase的结构。虽然添加有机溶剂可以提高环糊精的特异性和总收率，但是溶剂(如甲苯或丙酮)的毒性和从最终产品中除去溶剂的成本极大地限制了环糊精产品的大规模应用，特别是在食品和医药工业中。与使用有机溶剂相比，改变CGTase的结构的方法更环保且成本更低。因此，合理修饰CGTase以提高产物特异性至关重要。而β-CD由于自身的水溶性低、提纯相对容易，所以目前在实际工业应用上最为广泛的是β-CD，占据CDs生产量的主导地位。目前，凌国庆公开的硕士论文《蜡状芽孢杆菌β-CGTase发酵、基因克隆表达及其酶学性质研究》中公开一种高产β-CGTase的菌株，该菌株是利用氮离子对蜡状芽孢杆菌进行诱变选育获得，虽然其得到了了高产β-CGTase的菌株，但是不确定性较大、成本高。凌凯公开的硕士论文《环糊精糖基转移酶分子改造，产物特异性和酶学性质研究》中发现了来源于蜡状芽孢杆菌的CGTase43位氨基酸对CGTase产物特异性具有重要作用，其以重组质粒pET22b/cgt为模板，采用全质粒的突变方法对43位组氨酸进行饱和突变，最终获得对γ-CD特异性最好的突变酶，可见，凌凯虽然采用了顶点突变的方法获得突变酶，但其是针对γ-CD特异性的适用的，并不适用于工业应用的β-CD(即β环糊精糖基转移酶)，可见，目前急需一种能够直接获得用于β-CD的生产的工程菌及方法。
技术实现思路
为解决现有技术中对β-CD生产的问题，本专利技术旨在提供一种表达高特异性β环糊精糖基转移酶的基因工程菌及其构建方法和用途，为β-CD的工业生产提供更高的转化率，降低其成本。本专利技术所要解决的技术问题是通过基因工程的手段构建能表达高特异性β环糊精糖基转移酶(β-CGTase)的基因工程菌株，并通过诱导制备该酶用于β-CD的生产。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第一方面提供一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体，其是将蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的环糊精糖基转移酶基因的第47位丙氨酸进行定点突变获得。其中，所述突变体包括：将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser，命名为A47S；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为蛋氨酸Met，命名为A47M；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为酪氨酸Tyr，命名为A47Y；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为精氨酸Arg，命名为A47R。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第二方面提供一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的引物，包括如SEDIDNO.2-3所示的引入单突变体A47S的突变引物对；如SEDIDNO.4-5所示的引入单突变体A47M的突变引物对；如SEDIDNO.6-7所示的引入单突变体A47Y的突变引物对；如SEDIDNO.8-9所示的引入单突变体A47R的突变引物对中的任一一种或多种。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第三方面提供一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的试剂盒，包括第二方面所述的引物以及使环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala发生突变的试剂。其中，所述试剂包括：利用构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的引物对重组表达质粒pET22b-cgt模板进行突变合成，分别获得单突变体A47S、A47M、A47Y、A47R的试剂I；以及处理PCR产物，获得突变体的试剂II。其中，所述重组表达质粒是用pET22b-cgt基因插入到载体pET22b(即pET22b(+))中构建而成，载体pET22b购自Novagen公司。尤其是，所述pET22b-cgt基因是以蜡状芽孢杆菌基因组为模板，运用PCR扩增技术克隆得到的。进一步的，所述pET22b-cgt酶基因共有碱基2085bp，其碱基序列如SEQIDNO.1所示，GeneBank的登录号是AccessionNo.KF269705。其中，所述试剂I为cgt/pET-22b(+)1μL，ForwardPrimer(10μM)1μL，ReversePrimer(10μM)1μL，2×TransStartFastPfuPCRSupermix25μL，ddH2O22μL，总计50μL体积的反应体系。其中，使用试剂I的反应条件为：94℃预变性3min；接着进行30个循环(94℃10s，60℃20s，72℃4min)；最后72℃保温10min。需要说明的是，所述试剂I还可以使用总体积为其他体积数量的PCR扩增体系，本领域技术人员可以根据实际需求进行调整，反应条件也可以进行适应性调整，上述调整都在本专利技术的保护范围内。其中，所述试剂II为DMT酶。其中，所述DMT酶的用量为1μL。需要说明的是，所述试剂II还可以使用其他能够使PCR产物发生去甲基化模板的试剂，其用量根据常规试验进行调整。为实现本专利技术的技术目的，本专利技术第四方面提供一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的方法，包括：应用第二方面所述的引物或第三方面提供的试剂盒对重组表达质粒pET22b-cgt进行47位的丙氨酸突变，分别得到基因序列第47位突变为丝氨酸Ser的突变体A47S、变为蛋氨酸Met的突变体A47M、变为酪氨酸Tyr的突变体A47Y和变为精氨酸Arg的突变体A47R。为实现本专利技术的技术目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体，其特征在于，其是将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的环糊精糖基转移酶基因的第47位丙氨酸进行定点突变获得，包括：将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser，命名为A47S；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为蛋氨酸Met，命名为A47M；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为酪氨酸Tyr，命名为A47Y；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为精氨酸Arg，命名为A47R。

【技术特征摘要】
1.一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体，其特征在于，其是将蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的环糊精糖基转移酶基因的第47位丙氨酸进行定点突变获得，包括：将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为丝氨酸Ser，命名为A47S；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为蛋氨酸Met，命名为A47M；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为酪氨酸Tyr，命名为A47Y；将环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala突变为精氨酸Arg，命名为A47R。2.一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的引物，其特征在于，具有：如SEDIDNO.2-3所示的引入单突变体A47S的突变引物对；如SEDIDNO.4-5所示的引入单突变体A47M的突变引物对；如SEDIDNO.6-7所示的引入单突变体A47Y的突变引物对；如SEDIDNO.8-9所示的引入单突变体A47R的突变引物对。3.一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物以及使环糊精糖基转移酶基因中第47位的丙氨酸Ala发生突变的试剂。4.一种构建表达高特异性β环糊精糖基转移酶的突变体的方法，其特征在于，包括：应用权利要求2所述的引物或权利要求3所述试剂盒对重组表达质粒pET22b-cgt进行47位的丙氨酸突变，分别得到基因序列第47位突变为丝氨酸Ser的突变体A47S、变为蛋氨酸Met的突变体A47M、变为酪氨酸Tyr的突变体A47Y和变为精氨酸Arg的突变体A47R。5.一种表达高特异性β环糊精糖基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪斌，花敬涵，杨静文，胡雪芹，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34