本发明专利技术公开了一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用，糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码SEQ ID No.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术利用UGT10编码的蛋白，可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生成。为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生产提供了一种特异高效的生物合成方法。
【技术实现步骤摘要】
一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种特异合成呋喃酮葡萄糖苷的糖基转移酶及其应用。
技术介绍
呋喃酮(4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,Furaneol,DMHF)，又称菠萝酮或草莓酮。它是一种非常重要的香气，具有强烈的焙烤焦糖香味，特征香气为果香、焦香、焦糖和菠萝样香气。自从1965年J.O.Rodin等人在菠萝汁的乙醚萃取液中首次鉴定出呋喃酮以来，由于其低香气阈值、令人愉悦的香味和显著的增香效果，引起了合成者极大的兴趣，更博得风味研究工作者们的青睐。呋喃酮是用途极广的天然安全香料，广泛应用于食品、饮料、烟草、保健品等行业。呋喃酮在中国的香料香精行业具有不可替代的地位，是一种优良的甜味香料和增香剂，为美国食用香料制造者协会(FEMANO.3134)和欧洲理事会(COENO.536)共同认可的安全食用香料。呋喃酮同时也是植物中重要的香气物质，是草莓、葡萄、茶的风味中的重要组成部分。研究表明，呋喃酮是真正贡献于草莓风味的15种香气活性物质中最关键的一种。同时，也是某些葡萄品种制成葡萄酒的重要香气的组成成分。另外，呋喃酮也是茶叶一些香气的重要组成成分。近年来有研究表明，呋喃酮是茉莉花茶、乌龙茶中甜香及烘焙茶叶茎产生特征性风味中甜香和焦糖香的重要组成成分。研究表明，在植物体内，呋喃酮以一个未知的糖基转移酶催化的糖基化反应形成的糖苷，稳定存在于植物中。相比游离态香气物质，香气糖苷性质更稳定，水溶性更强，且具有多种重要的生物学功能，在化妆品、食品和药物开发领域具有巨大的商业价值。香气糖苷主要由UGT通过糖基化作用催化合成。糖苷化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，在调节植物细胞代谢平衡、解除外源毒素毒性、维持植物正常生长发育等方面具有重要作用，同时也可以通过代谢工程途径改善植物的香气成分。目前，香气糖苷的合成主要通过化学和生物两种手段实现，生物合成由于使用酶或者工程菌在常温下进行转化，对环境无污染，且对位点选择性较强，产物单一，不需要外源催化剂的使用，安全可靠，在功能食品中具有非常大的潜力。但目前多种香气糖苷生物合成的方法还不成熟，其中呋喃酮糖苷的相关研究很少。已报道的呋喃酮相关的糖基转移酶不能特异高效催化呋喃酮糖苷的生成，多数利用底物广泛，合成呋喃酮糖苷能力弱。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶及编码基因，解决呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生物合成难题。本专利技术的技术方案为：一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。一种编码SEQIDNo.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。表达载体，其包含SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。SEQIDNo.1所示的糖基转移酶或SEQIDNo.2所示的基因UGT10在合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷上的应用。一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：(1)以茶树cDNA为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQIDNo.2所示的基因UGT10；(2)将步骤(1)得到的基因UGT10进行原核表达；(3)分离纯化得到氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的葡萄糖基转移酶；(4)以呋喃酮或呋喃酮衍生物为底物，以SEQIDNo.1所示的糖基转移酶进行催化反应，得到呋喃酮葡萄糖苷或呋喃酮衍生物葡萄糖苷。进一步地，所述呋喃酮衍生物为2-乙基-4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或单甲基呋喃酮。进一步地，催化反应的条件为：温度25℃-35℃、pH值6.5-10。优选地，催化反应的条件为：温度30℃、pH值8.5。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用UGT10编码的蛋白，可以特异高效的催化呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生成。为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生产提供了一种特异高效的生物合成方法。附图说明图1：香气底物的筛选；图2：不同反应时间的酶活数据；图3：不同pH的酶活数据；图4：不同温度酶活数据；图5：为呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的获得流程图。具体实施方式1、UGT10基因在茶树基因组中，发现了一条糖基转移酶相关的基因，该基因编码的蛋白可以特异性利用呋喃酮及其衍生物，生成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷，将该基因命名为UGT10，该基因的CDS序列如SEQIDNo.2所示。2、UGT10基因的克隆根据上述UGT10的CDS，通过SnapGeneViewer软件设计引物，用茶树的cDNA为模板，用高保真酶克隆目的基因，之后通过商业化的试剂盒进行胶回收，获得单一的目的基因。cDNA模板的获取：将茶叶的鲜叶液氮处理磨碎后，用商业化提取植物RNA试剂盒提取，之后用商业化反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。UGT10基因的引物序列：UGT10F：GGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGAGACACCAAACAGAGC(SEQIDNo.3)UGT10R：GCTCGAGTCGACCCGGGTTAGGATCGCACTAATTCAGCTAC(SEQIDNo.4)反应体系：反应程序：3、重组质粒pGEX4T1-UGT10的构建将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-UGT10，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。4、UGT10基因的原核表达与纯化将构建成功的表达载体pGEX4T1-UGT10转化到BL21感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中37℃过夜培养，在37℃条件下进行扩大培养，直至OD600＝0.6-0.8为止。冷却至16-18℃后，加入1M的IPTG在16℃培养室内诱导过夜。第二天离心收集菌落，超声破碎，按照文献中的优化的糖基转移酶的方法纯化蛋白(SongC,HongX,ZhaoS,etal.Glucosylationof4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone,theKeyStrawberryFlavorCompoundinStrawberryFruit[J].PlantPhysiol.2016,171(1):139-151；SongC,RingL,HoffmannT,etal.AcylphloroglucinolBiosynthesisinStrawberryFruit[J].PlantPhysiol.2015,169(3):1656-1670；SongC,GuL,LiuJ,etal.FunctionalCharacterizationandSubstratePromiscuityofUGT71GlycosyltransferasesfromStrawberry(Fragaria×ananassa)[J].PlantandCellPhysiology.2015,56(12))，并进行SDS-PAGE检测。该蛋白的氨基酸序列如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种编码SEQIDNo.1所示的糖基转移酶的基因UGT10，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.表达载体，其包含SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。4.SEQIDNo.1所示的糖基转移酶或SEQIDNo.2所示的基因UGT10在合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷上的应用。5.一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以茶树cDNA为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQIDNo.2所示的基因UGT10；(2)将步骤(1)得到的基因UGT10进...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋传奎，陈永先，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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