本发明专利技术公开了一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，该基因全长1383bp，编码461个氨基酸，酶蛋白分子量大小为54KDa，以pET28a大肠杆菌蛋白表达质粒为载体，以大肠杆菌BL21为宿主，实现了苦皮藤酰基转移酶18466的异源表达，以香叶醇为底物酰基化生成单萜酯化合物。因此研究酰基转移酶的功能及其序列特征对萜类化合物的酯化物具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列
本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于苦皮藤(Celastrμsangμlatμs)的酰基转移酶18466以及基因序列C-18466。
技术介绍
萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸Dimethylallyldiphosphate，DMAPP和异戊烯基焦磷酸Isopentenyldiphosphate，IPP来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(C10)倍半萜(C15)和二萜(C20)等天然产物。单萜类化合物是萜类化合物中结构和种类最丰富的一种，已经被广泛应用于生物制药、天然绿色农药杀虫和杀菌剂、燃料替代品和食品级香料和调味剂等行业开发使用。香叶醇是一个非环单萜醇类化合物，它是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇及其酯广泛用作日用香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，用于配制日用产品和食品。在植物生长发育过程中存在着各种次生代谢产物的修饰过程，如氧化还原、糖基化、甲基化、羟基化和酰基化反应过程。其中酰基化是修饰植物次生代谢产物的一个至关重要的过程，能改变次级代谢物的挥发性、极性、化学稳定性和生物活性。该过程需要酰基转移的催化。酰基转移酶是一类具有多功能的蛋白质大家族，不同的酰基转移酶对生物体的遗传、基因的表达、物质代谢和信号传导等过程起重要的作用。因此研究酰基转移酶的功能及其序列特征对萜类化合物的酯化物具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，还提供了包含本专利技术基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(重组菌)诱导表达该苦皮藤酰基转移酶18466，以香叶醇为底物酰基化生成单萜酯化合物。本专利技术的技术方案是：一种苦皮藤酰基转移酶，记为18466，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码上述苦皮藤酰基转移酶18466的基因，记为C-18466，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组质粒，记为pET28a-His6-18466，含有编码苦皮藤酰基转移酶18466的基因，诱导型启动子T7，6个组氨酸筛选标签。一种重组菌，记为BL21/pET28a-His6-18466，含有上述重组质粒。本专利技术的有益效果是：本专利技术一种苦皮藤酰基转移酶18466及其基因序列，该基因全长1383bp，编码461个氨基酸，酶蛋白分子量大小为54KDa，以pET28a大肠杆菌蛋白表达质粒为载体，以大肠杆菌BL21为宿主，实现了苦皮藤酰基转移酶18466的异源表达，以香叶醇为底物体外酰基化生成乙酸香叶酯和苯甲酸香叶酯，对单萜酯的生产及运用具有重要意义，同时该基因的获得对植物萜类酰基化修饰机制和生物胁迫机理研究奠定基础。附图说明图1为BL21/pET28a-His6-18466重组大肠菌株验证DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1383bp)；M：标准DNA分子尺；泳道1为C-18466基因DNA样品；图2为BL21/pET28a-His6-18466重组大肠菌株验证蛋白表达SDS-Page凝胶图谱(目的蛋白分子量大小为54kDa)；图3为BL21/pET28a-His6-18466酰基转移酶体外酰基化产物GC-MS图谱；A为酰基化产物的GC图谱；B为保留时间8.41min峰的质谱图和NIST14谱库中乙酸香叶酯质谱图比较；C为保留时间14.00min峰的质谱图和NIST14谱库中苯甲酸香叶酯质谱图比较。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术倍半萜合成酶基因来源于苦皮藤植株，植物在2017年5月11日采集于陕西省杨凌示范区西北农林大学博览园。选用新鲜采集的苦皮藤植株进行RNA提取，并通过反转录PCR获得其cDNA序列，构建cDNA文库。使用PacBioISO-Seq平台进行测序，通过在Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro)中进行BLAST比对获得具有BAHDfamily结构域的目的基因。以cDNA序列为模板，设计引物扩增C-18466基因序列，并通过酶切连接到pET28a-His6-18466质粒上，转化获得BL21/pET28a-His6-18466大肠宿主(E.coliBL21)表达质粒，实现苦皮藤酰基转移酶18466的高效表达。实施例1.所述的BL21/pET28a-His6-18466菌株苦皮藤酰基转移酶18466的克隆及表达。采用RNApreppurePlantKit提取苦皮藤总RNA。采用ClontechSMARTerPCRcDNASynthesisKit合成第一链cDNA，第一链cDNA经过PCR扩增合成第二链cDNA，然后双链DNA经过二次PCR扩增后，用于SMRTbell建库，并采用PacBioISO-Seq平台进行测序。根据测序获得的C-18466基因序列SEQIDNO.2，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：引物C-18466-F:5'CGCGGATCCCATGGGCGGATCCGCCAG3'(SEQIDNO.3)引物C-18466-R：5'CCGCTCCTCGAGTAAAGCGCTGATGATCAGAC3'(SEQIDNO.4)以反转录获得的cDNA序列为模板，采用上述引物，PCR扩增C-18466基因序列。反应体系为50μl，包括ddH2O18μl，dNTPmixtμre1μl,C-18466-F引物1μl，C-18466-R引物1μl，DNA模板1μl，2×PhantaMax25μl，FidelityDNApolymerase1μl。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小，用ΜniversalDNAPurificationKit回收目的片段。用NcoI和XhoI酶切纯化的DNA片段和pET28a质粒，酶切后的产物经过ΜniversalDNAPurificationKit回收得到酶切片段，经过T4DNAligase连接酶进行连接，得到重组质粒。酶切体系为：NcoI1.5μL，XhoI1.5μL，DNA片段或质粒42μL，cutsmartbuffer5μL。37℃水浴2h。连接体系为：目的酶切基因片段7μL与酶切质粒1μL，T4连接酶1μL，10×T4ligasebμffer1μL。16℃过夜连接。采用大肠杆菌电转化法，进行BL21转化，操作步骤如下：(1)大肠BL21的感受态标准规格每管含有100μL感受态细胞(取出置于冰上)。(2)1.5mLEP管中加入2μL连接产物和80μL感受态细胞，轻轻混合均匀，置于冰中预冷5min，再转入预冷的电击杯中2.5kV电击，电击参数一般在3.5ms左右。(3)取1mLLB培养基加入电转杯，轻轻吸打，并转至1.5mL离心管中，37℃下复苏培养45-60min。(4)复苏后，5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苦皮藤酰基转移酶，记为18466，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种苦皮藤酰基转移酶，记为18466，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述苦皮藤酰基转移酶的基因，记为C-18466，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔建军，秦小淯，闫晓光，张雷，李伟国，梁冬梅，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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