使用融合蛋白进行T细胞受体重编程的组合物和方法技术

本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程化为表达一种或多种TFP的T细胞及其用于治疗包括癌症在内的疾病的使用方法。

Compositions and methods of T cell receptor reprogramming using fusion proteins

This article provides T cell receptor (TCR) fusion protein (TFP), engineered T cells expressing one or more TFPs, and their use in the treatment of diseases including cancer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用融合蛋白进行T细胞受体重编程的组合物和方法交叉引用本申请要求于2016年10月7日提交的美国临时申请号62/405,551和于2017年5月23日提交的美国临时申请号62/510,108的权益，这些临时申请各自通过引用整体并入本文。专利技术背景大多数晚期实体瘤患者无法用标准疗法治愈。此外，传统的治疗选择通常会产生严重的副作用。已经进行了许多尝试以使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。然而，一些障碍使得实现临床有效性相当困难。尽管已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常来源于自身，因此可引导癌症免疫疗法针对健康组织，或者具有较差的免疫原性。此外，癌细胞使用多种机制使其自身对癌症免疫疗法的免疫攻击而言不可见或抵抗其起始和传播。最近的发展使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞疗法，其依赖于将基因工程化T细胞重定向至癌细胞上合适的细胞表面分子，这在利用免疫系统的能力治疗B细胞恶性肿瘤方面显示出有希望的结果(参见例如，Sadelain等人,CancerDiscovery3:388-398(2013))。CD-19特异性CART细胞(称为CTL019)的临床结果显示患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)以及儿童急性淋巴母细胞白血病(ALL)的患者完全缓解(参见例如，Kalos等人,SciTranslMed3:95ra73(2011)，Porte等人,NEJM365:725-733(2011)，Grupp等人,NEJM368:1509-1518(2013))。替代方法是使用针对肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α链和β链对自体T细胞进行基因工程化。这些TCR链将形成完整的TCR复合物，并为T细胞提供TCR以具有第二限定特异性。在滑膜癌患者中用表达NY-ESO-1特异性TCRα链和β链的工程化自体T细胞获得了令人鼓舞的结果。除了表达CAR或第二TCR的遗传修饰的T细胞在体外/离体识别和破坏相应靶细胞的能力之外，用工程化T细胞进行成功的患者治疗还需要T细胞能够随时间强劲激活、扩充、持续，并且在疾病复发的情况下能够实现“记忆”反应。CART细胞较高且可管理的临床功效目前仅限于BCMA阳性和CD-19阳性B细胞恶性肿瘤以及表达HLA-A2的表达NY-ESO-1-肽的滑膜肉瘤患者。对于改进基因工程化T细胞以更广泛地对抗各种人类恶性肿瘤存在明确需求。本文描述了包括CD3ε、CD3γ和CD3δ在内的TCR亚单位的新型融合蛋白，以及具有对细胞表面抗原有特异性的结合结构域的TCRα和TCRβ链的新型融合蛋白，其具有克服现有方法的局限性的潜力。本文描述了相比CAR更有效地杀伤靶细胞，但释放相当或更低水平的促炎细胞因子的新型融合蛋白。这些融合蛋白及其使用方法表现出T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)相对于CAR的优势，因为这些细胞因子升高的水平与过继CAR-T疗法的剂量限制性毒性相关。
技术实现思路
本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程化为表达一种或多种TFP的T细胞，及其用于治疗疾病的使用方法。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位以及包含抗间皮素结合结构域的人或人源化抗体结构域。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域的至少一部分和包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域的至少一部分和包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域的至少一部分和包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域的至少一部分和包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域的至少一部分和包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：TCR亚单位以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域。在一些情况下，所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接。在一些情况下，所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一些情况下，所编码的抗原结合结构域通过连接体序列与所述TCR细胞外结构域连接。在一些情况下，所编码的连接体序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情况下，所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域。在一些情况下，所述TCR亚单位包含TCR跨膜结构域。在一些情况下，所述TCR亚单位包含TCR细胞内结构域。在一些情况下，所述TCR亚单位包含(i)TCR细胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的TCR亚单位。在一些情况下，所述TCR亚单位包含TCR细胞内结构域，所述TCR细胞内结构域包含选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域，或其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。在一些情况下，所述TCR亚单位包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或其具有至少一个修饰的氨基酸序列。在一些情况下，所述人或人源化抗体结构域包含抗体片段。在一些情况下，所述人或人源化抗体结构域包含scFv或VH结构域。在一些情况下，所述分离的核酸分子编码(i)抗间皮素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.07 US 62/405,551;2017.05.23 US 62/510,1081.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。2.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。3.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。4.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。5.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。6.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含：(a)TCR亚单位，其包含：(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR细胞内结构域；以及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接，并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。7.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述TFP包含TCR亚单位以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域。8.如权利要求7所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位和所述抗体结构域可操作地连接。9.如权利要求7或8所述的分离的核酸分子，其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的核酸分子，其中所编码的抗原结合结构域通过连接体序列与所述TCR细胞外结构域连接。11.如权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所编码的连接体序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。12.如权利要求1-11中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含TCR细胞外结构域。13.如权利要求1-12中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含TCR跨膜结构域。14.如权利要求1-13中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含TCR细胞内结构域。15.如权利要求1-14中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含(i)TCR细胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自相同的TCR亚单位。16.如权利要求1-15中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含TCR细胞内结构域，所述TCR细胞内结构域包含选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激结构域，或其具有至少一个修饰的氨基酸序列。17.如权利要求1-16中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚单位包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或其具有至少一个修饰的氨基酸序列。18.如权利要求1-17中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包含抗体片段。19.如权利要求1-18中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包含scFv或VH结构域。20.如权利要求1-19中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包含sdAb或VHH结构域。21.如权利要求1-20中任一项所述的分离的核酸分子，其编码(i)抗间皮素轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LCCDR2和LCCDR3，其分别与本文提供的抗间皮素轻链结合结构域的轻链(LC)CDR1、LCCDR2和LCCDR3具有70-100％的序列同一性，和/或(ii)抗间皮素重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HCCDR2和HCCDR3，其分别与本文提供的抗间皮素重链结合结构域的重链(HC)CDR1、HCCDR2和HCCDR3具有70-100％的序列同一性。22.如权利要求1-21中任一项所述的分离的核酸分子，其编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含相对于本文提供的轻链可变区的轻链可变区氨基酸序列具有至少一个但不多于30个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的轻链可变区的轻链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。23.如权利要求1-22中任一项所述的分离的核酸分子，其编码重链可变区，其中所述重链可变区包含相对于本文提供的重链可变区的重链可变区氨基酸序列具有至少一个但不多于30个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的重链可变区的重链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。24.如权利要求1-23中任一项所述的分离的核酸分子，其编码重链可变区，其中所述重链可变区包含相对于本文提供的重链可变区的重链可变区氨基酸序列具有至少一个但不多于30个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的VHH区的单结构域抗体氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。25.如权利要求24所述的分离的核酸分子，其中所述VHH区的序列在本文提供的序列中列出。26.如权利要求1-23中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包含TCR亚单位的细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自下组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、其功能片段及其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列。27.如权利要求1-26中任一项所述的分离的核酸分子，其中所编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自下组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、其功能片段及其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列。28.如权利要求1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自下组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段及其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列。29.如权利要求1-28中任一项所述的分离的核酸分子，其进一步包含编码共刺激结构域的序列。30.如权利要求29所述的分离的核酸分子，其中所述共刺激结构域是从选自下组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)及其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列。31.如权利要求1-30中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个但不多于20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸修饰或响应于配体与所述TFP结合而磷酸化的氨基酸修饰。32.如权利要求1-31中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子为mRNA。33.如权利要求1-32中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包含TCR亚单位的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，所述ITAM包括选自下组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚单位、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段及其具有至少一个但不多于20个修饰的氨基酸序列。34.如权利要求33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM取代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。35.如权利要求33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM选自CD3ζTCR亚单位、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位和CD3δTCR亚单位，并取代选自CD3ζTCR亚单位、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位和CD3δTCR亚单位的不同ITAM。36.如权利要求1-35中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核酸包含核苷酸类似物。37.如权利要求36所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟代、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的、锁定核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸和2’-氟代N3-P5’-亚磷酰胺。38.如权利要求1-37中任一项所述的分离的核酸分子，其进一步包含前导序列。39.如权利要求1-38中任一项所述的分离的核酸分子，其中包含作为由所述核酸编码的抗间皮素结合结构域的抗原结合结构域的所述人或人源化抗体结构域，或包含所述抗间皮素结合结构域的抗体，或表达由所述核酸编码的抗间皮素结合结构域的细胞，具有以下亲和力值：至多约200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、20nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM、0.05nM、0.04nM、0.03nM、0.02nM或0.01nM；和/或至少约100nM、75nM、50nM、25nM、20nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕特里克·博伊尔勒，格雷戈里·西兹克维克兹，罗伯特·霍夫梅斯特，
申请(专利权)人：T细胞受体治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US