使用融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法技术

本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸，表达所编码的分子的修饰的人免疫细胞，及其用于治疗包括癌症在内的疾病的方法。的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求2019年4月22日提交的美国临时申请号62/836,977和2019年12月4日提交的美国临时申请号62/943,679的权益，其各自通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0003]癌症是美国和其它地方死亡的主要原因。根据癌症的类型，通常用手术、化疗和/或放疗进行治疗。这些治疗通常失败，并且显然需要新的治疗，以单独使用或与当前的护理标准组合使用。
[0004]大多数患有血液恶性肿瘤或晚期实体瘤的患者不能用标准疗法治愈。此外，传统的治疗选择通常具有严重的副作用。已经进行了许多尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。
[0005]工程化T细胞疗法在清除实体瘤方面的成功取决于所述T细胞在免疫抑制性肿瘤微环境(TME)中起作用的能力。已经采用或正在开发克服TME的多种策略。许多方法直接修饰和工程化T细胞以表达多个共刺激结构域(例如cd40的组成型表达)、以分泌促炎细胞因子如IL
‑
12和/或阻断抑制信号的抗体(如抗PD1)(参见例如Yeku&Brentjens，2016)。
[0006]例如，通过遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的肿瘤特异性T细胞的产生已获得产生强抗肿瘤作用的吸引力(Jena等人，2010，Blood.116：1035
‑
1044；Bonini等人，2011，Biol Blood Marrow Transplant 17(1 Suppl)：515
‑
20；Restifo等人，2012，Nat Rev Immunol 12：269
‑
281；Kohn等人，2011，Mol Ther 19：432
‑
438；Savoldo等人，2011，J Clin Invest 121：1822
‑
1825；Ertl等人，2011，Cancer Res 71：3175
‑
3181)。
[0007]CD19特异性CAR T细胞(称为CTL019)的临床结果在患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及儿童急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者中显示完全缓解(参见例如，Kalos等人，Sci Transl Med 3：95ra73(2011)，Porter等人，NEJM 365：725
‑
733(2011)，Grupp等人，NEJM 368：1509
‑
1518(2013))。另一种方法是使用为肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α和β链来遗传工程化自体T细胞。这些TCR链将形成完整的TCR复合物，并为T细胞提供具有第二确定特异性的TCR。在滑液癌患者中用表达NY
‑
ESO
‑1‑
特异性TCRα和β链的工程化自体T细胞获得了令人鼓舞的结果。最近的方法是改进基因工程化的T细胞以更广泛地对抗各种人恶性肿瘤。TCR亚单位(包括CD3ε、CD3γ和CD3δ)和TCRα和TCRβ链与细胞表面抗原特异性结合结构域的新融合蛋白已显示出超过现有方法限制的潜力。参见例如2016年5月18日提交的共同未决的国际申请号PCT/US2016/033146；2017年8月2日提交的PCT/US2017/045159；和2018年6月13日提交的PCT/US2018/037387，其各自通过引用并入本文。
[0008]不幸的是，为了实现有效的蛋白质表达，这些方法中的许多已经面临在T细胞内递送药物组合物的技术限制。
[0009]编码蛋白质的基因的大尺寸对工程化T细胞如融合蛋白提出了技术限制和挑战。将这些大基因编码到产生T细胞所必需的活载体中是复杂的。此外，即使成功产生载体，也不总是观察到T细胞转导效率和稳定的蛋白质表达。这可能与转录、翻译和最终蛋白质分泌
相关的漫长而复杂的过程有关。据推测，这些蛋白质中的许多不是由T细胞内源性表达的事实可使其进一步复杂化。
[0010]例如，在将重组DNA递送到细胞中之后，但在产生可影响蛋白质表达的编码蛋白质之前，可能发生多个步骤。一旦进入细胞，DNA可被转运到细胞核中，在细胞核中它被转录成mRNA。从DNA转录的mRNA然后可以进入细胞质，在那里它被翻译成蛋白质。从施用的DNA到蛋白的多个加工步骤不仅在产生功能蛋白之前产生滞后时间，而且每个步骤都代表了错误和损伤细胞的机会。此外，已知难以在细胞中获得DNA表达，因为DNA经常进入细胞但不表达或不以合理的速率或浓度表达。当DNA被引入原代细胞或修饰的细胞系时，这可能是特别的问题。

技术实现思路

[0011]本文认识到需要递送生物形式以解决围绕细胞内翻译的调节和编码多肽的核酸的加工的缺陷，并因此优化来自递送形式的蛋白质表达。
[0012]显然需要改进基因工程化的T细胞以更广泛地对抗各种人恶性肿瘤，例如癌症。
[0013]以下公开内容中的组合物和方法已经被设计成通过递送包含核酸如环状RNA(circRNA)的组合物来解决这种需要。
[0014]因此，在一个方面，本文公开了分离的重组核酸分子，其包含：(A)一种或多种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的核糖核酸(RNA)序列，所述TFP包含(a)TCR亚单位，所述TCR亚单位包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中所述TCR亚单位的胞外、跨膜和/或胞内信号传导结构域衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ或TCRα或TCRβ或TCRδ或TCRγ；和(b)抗原结合结构域；其中所述TCR亚单位与所述抗原结合域可操作地连接；且其中当在T细胞中表达时，TFP并入TCR中；和(B)一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)；其中(A)和(B)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。在一个实施方案中，TCR胞内结构域包含衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ的刺激结构域。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。在一个实施方案中，分离的重组核酸分子还包含邻近(A)的5
’
端和(B)的3
’
端的(C)核酸间隔序列，其中(C)通过线性核酸的环化形成。在一个实施方案中，间隔序列的长度为约30
‑
100个核苷酸。在另一个实施方案中，线性核酸的环化产生环状RNA分子。在另一个实施方案中，环状重组核酸分子是外源的。在另一个实施方案中，IRES包含来自柯萨奇病毒B3(CVB3)或来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。在另一个实施方案中，环状重组核酸分子适于转染或转导到同种异体或自体人免疫细胞中。
[0015]在另一方面，提供了分离的重组核酸分子，其包含：(A)一种或多种编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核糖核酸(RNA)序列；和(B)一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)；其中(A)和(B)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。在一个实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的重组核酸分子，其包含：(A)一种或多种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的核糖核酸(RNA)序列，所述TFP包含(a)TCR亚单位，所述TCR亚单位包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中所述TCR亚单位的胞外、跨膜和/或胞内结构域衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ或TCRα或TCRβ或TCRδ或TCRγ；和(b)抗原结合结构域；其中所述TCR亚单位与所述抗原结合域可操作地连接；且其中当在T细胞中表达时，所述TFP并入TCR中；和(B)一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)；其中(A)和(B)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。2.如权利要求1所述的分离的重组核酸分子，其中所述TCR胞内结构域包含衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ的刺激结构域。3.如权利要求1或2所述的分离的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含邻近(A)的5
’
端和(B)的3
’
端的(C)核酸间隔序列，其中(C)通过线性核酸的环化形成。5.如权利要求4所述的分离的重组核酸分子，其中所述间隔序列的长度为约30
‑
100个核苷酸。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述线性核酸的环化产生环状RNA分子。7.如权利要求6所述的分离的重组核酸分子，其中环状重组核酸分子是外源的。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述IRES包含来自柯萨奇病毒B3(CVB3)或来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述环状重组核酸分子适于转染或转导到同种异体或自体人免疫细胞中。10.一种分离的重组核酸分子，其包含：(A)一种或多种编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核糖核酸(RNA)序列；和(B)一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)；其中(A)和(B)可操作地连接以形成环状重组核酸分子。11.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子，其还包含邻近(A)的5
’
端和(B)的3
’
端的(C)核酸间隔序列，其中(C)通过线性核酸的环化形成。12.如权利要求11所述的分离的重组核酸分子，其中所述间隔序列的长度为约30
‑
100个核苷酸。13.如权利要求10
‑
12中任一项所述的环状重组核酸分子，其中所述分离的重组核酸分子是外源的。14.如权利要求10
‑
13中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述IRES还包含获自柯萨奇病毒B3(CVB3)或获自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES。15.一种分离的重组核酸分子，其包含(A)一种或多种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的脱氧核糖核酸(DNA)序列，所述TFP包含(a)TCR亚单位，所述TCR亚单位包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，(ii)跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中所述TCR亚单位的胞外、跨膜和/或胞内结构域衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ或TCRα或TCRβ或TCRδ或TCRγ；和(b)抗原结合结构域；其中所述TCR亚单位与所述抗原结合结构域可操作地连接；且其中当在T细胞中表达时，所述TFP并入TCR中；(B)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位
点(IRES)的DNA序列；和(C)一种或多种包含第一环化结构域的DNA序列，所述第一环化结构域包含5
′
同源序列和3
′
置换的内含子
‑
外显子(PIE)序列中的至少一个；和(D)一种或多种包含第二环化结构域的DNA序列，所述第二环化结构域包含3
′
同源序列和5
′
PIE序列中的至少一个，其中(A)和(B)可操作地连接。16.如权利要求15所述的分离的重组核酸分子，其中所述TCR胞内结构域包含衍生自CD3ε或CD3γ或CD3δ的刺激结构域。17.如权利要求15或16所述的分离的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域包含抗体或抗体片段。18.如权利要求15
‑
17中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中(A)
‑
(D)以取向(C)
‑
(B)
‑
(A)
‑
(D)可操作地连接。19.如权利要求15
‑
18中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述一种或多种DNA序列还包含至少一个间隔序列。20.如权利要求19所述的分离的重组核酸分子，其中所述间隔序列的长度为至少约30
‑
100个核苷酸。21.如权利要求15
‑
20中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述核酸分子是外源的。22.如权利要求15
‑
21中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述核酸分子是质粒。23.如权利要求15
‑
22中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述核酸分子还包含对肿瘤相关抗原(TAA)具有特异性的抗原结合结构域。24.如权利要求15
‑
23中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述IRES包含来自柯萨奇病毒B3(CVB3)或来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。25.如权利要求15
‑
24中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含至少一个额外的5
′
同源序列和一个额外的3
′
同源序列。26.一种分离的重组核酸分子，其包含(A)一种或多种编码CAR或TCR的脱氧核糖核酸(DNA)序列；和(B)一种或多种包含一种或多种内部核糖体进入位点(IRES)的DNA序列；和(C)一种或多种包含第一环化结构域的DNA序列，所述第一环化结构域包含5
′
同源序列和3
′
置换的内含子
‑
外显子(PIE)序列中的至少一个；和(D)一种或多种包含第二环化结构域的DNA序列，所述第二环化结构域包含3
′
同源序列和5
′
PIE序列中的至少一个，其中(A)和(B)可操作地连接。27.如权利要求26所述的分离的重组核酸分子，其中(A)
‑
(D)以取向(C)
‑
(B)
‑
(A)
‑
(D)可操作地连接。28.如权利要求26或27所述的分离的重组核酸分子，其中所述一种或多种DNA序列还包含至少一个间隔序列。29.如权利要求28所述的分离的重组核酸分子，其中所述间隔序列的长度为至少约30
‑
100个核苷酸。30.如权利要求26
‑
29中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述核酸分子是外源的。31.如权利要求26
‑
30中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述核酸分子是质
粒。32.如权利要求26
‑
31中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含编码的抗原结合结构域。33.如权利要求26
‑
32中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述IRES包含来自柯萨奇病毒B3(CVB3)或来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。34.如权利要求26
‑
33中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含至少一个额外的5
′
同源序列和一个额外的3
′
同源序列。35.如权利要求1
‑
9或15
‑
25中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述编码抗原结合结构域的序列通过接头序列与编码所述TCR胞外结构域的序列连接。36.如权利要求35所述的分离的重组核酸分子，其中所述接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。37.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或32
‑
36中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述编码的抗原结合结构域特异性结合肿瘤相关抗原。38.如权利要求37所述的分离的重组核酸分子，其中所述肿瘤相关抗原是CD19或其变体、CD20、CD22、BCMA、MSLN、IL13Ra2、EGFRvIII、MUC16、MUC1、ROR1或其组合。39.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
38中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述编码的跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRδ链、TCRγ链、CD3ζTCR亚单位、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。40.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
39中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含编码共刺激结构域的序列，其中所述编码的共刺激结构域是选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CD5、ICAM
‑
1、LFA
‑
1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4
‑
1BB(CD137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。41.如权利要求35
‑
40中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中对其的至少一个但不超过20个修饰包括调节细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与编码的TFP或CAR或TCR结合而磷酸化的氨基酸的修饰。42.如权利要求35
‑
41中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中编码的TFP或CAR或TCR还包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其部分，其中所述ITAM或其部分来自选自由以下组成的组的蛋白质：CD3ζTCR亚单位、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。43.如权利要求42所述的分离的重组核酸分子，其中所述ITAM或其部分替换TCR胞内结构域的ITAM；其中所述TCR胞内结构域的替换的ITAM仅衍生自CD3ε或CD3γ，并且不同于替换它的ITAM或其部分。44.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
43中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中编码的TFP分子能够与内源性TCR复合物、至少一种内源性TCR多肽或其组合在功能上相互作用。
45.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
44中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域是scFv或VHH结构域。46.如权利要求1
‑
45中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述分离的重组核酸分子包含在细胞中。47.如权利要求46所述的分离的重组核酸分子，其中所述细胞是CD8+或CD4+或CD8+CD4+人免疫细胞。48.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或32
‑
47中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与细胞表面抗原结合。49.如权利要求11
‑
9、15
‑
25或32
‑
48中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述抗原结合结构域与肿瘤细胞表面上的细胞表面抗原结合。50.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
49中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含编码TCR恒定结构域的序列，其中当在T细胞中表达时，所述TCR恒定结构域并入功能性TCR复合物中。51.如权利要求50所述的分离的重组核酸分子，其中所述TCR恒定结构域并入与在T细胞中表达时并入TFP的功能性TCR复合物相同的功能性TCR复合物。52.如权利要求50或权利要求51所述的分离的重组核酸分子，其中所述编码TFP的序列和所述编码TCR恒定结构域的序列包含在同一核酸分子中。53.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
52中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中所述跨膜结构域是来自CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的T细胞受体复合物跨膜结构域。54.如权利要求1
‑
9、15
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25或35
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53所述的分离的重组核酸分子，其中所述胞内结构域仅衍生自CD3ε、仅衍生自CD3γ、仅衍生自CD3δ、仅衍生自TCRα、仅衍生自TCRβ、仅衍生自TCRδ或仅衍生自TCRγ。55.如权利要求1
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9、15
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25或35
‑
54中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含编码共刺激结构域的序列。56.如权利要求55所述的分离的重组核酸分子，其中所述共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM
‑
1、LFA
‑
1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4
‑
1BB(CD137)、及具有对其的至少一个但不超过20个修饰的其氨基酸序列。57.如权利要求1
‑
9、15
‑
25或35
‑
56中任一项所述的分离的重组核酸分子，其还包含编码蛋白质转导结构域或细胞穿透肽的序列。58.如权利要求1
‑
14或35
‑
57中任一项所述的分离的重组核酸分子，其中当转导或转染到T细胞中时，所述环状重组核酸分子的免疫原性低于shRNA、或双链RNA或其类似物。59.如权利要求58所述的分离的重组核酸分子，其中所述双链RNA或其类似物是聚I∶C。60.一种离体产生修饰的人免疫细胞的方法，其包括用如权利要求1
‑
59中任一项所述的分离的重组核酸分子转导或转染所述免疫细胞。61.如权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。62.如权利要求60或61所述的方法，其中所述免疫细胞是选自包含以下的组的人T细胞：CD4+细胞、CD8细胞、初始T细胞、记忆干T细胞、中枢记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T
细胞、效应T细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普，
申请(专利权)人：T细胞受体治疗公司，
类型：发明
国别省市：