人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；2)将得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。还公开了利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法：还包括步骤4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。还公开了获得重组人PAK1蛋白的方法：还包括步骤5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，离心收集上清，通过色谱柱纯化，即得。得。

【技术实现步骤摘要】
人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，涉及重组蛋白真核表达技术，尤其涉及一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法、表达和纯化方法。

技术介绍

[0002]蛋白激酶(protein kinases，简称PK)，是催化蛋白质磷酸化过程的酶。蛋白质的磷酸化过程是神经信息在细胞内传递的最后环节，导致离子通道蛋白及通道门的状态变化，是体内信号通路极其重要的组成部分，在神经细胞内有许多种类。因此，蛋白激酶的活力受到多种方式的调控，其中一种很常见的方式就是自磷酸化激活。PAK(p21
‑
activated kinase)蛋白家族在多种细胞过程中起着重要的作用，也受到相当精细的调控；PAK1是这个家族的代表性成员，其活力受到其N 端调控结构域及自磷酸化反应的调节，其活化环上一个保守的苏氨酸位点的磷酸化是其激活所必须的。
[0003]目前有很多关于人PAK1蛋白重组及表达的方法，但都是利用大肠杆菌系统表达，另外一个事实是目前市售的PAK1蛋白单抗在建立PAK1蛋白检测方法时，绝大多数抗体都存在特异性差、灵敏度低的缺点。我们认为利用原核系统进行蛋白表达过程中，由于缺乏与天然PAK1蛋白相同的表达环境导致重组的PAK1蛋白与天然PAK1蛋白结构有差异之处，导致制备出来的单抗存在识别天然PAK1 蛋白特异性差和灵敏度低的缺点。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0005]1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；
[0006]2)将步骤1)得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；
[0007]3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。
[0008]在上述技术方案中，步骤2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1，将将步骤1) 得到的PAK1基因片段和pcDNA3.1分别采用限制性内切酶BamHI、EcoRI消化后，连接消化产物得到重组质粒。
[0009]或者，步骤2)中所述真核表达载体为pCMV
‑
blank，先将步骤1)得到的PAK1 基因片段采用T载体克隆，鉴定测序正确的克隆质粒与pCMV
‑
blank分别采用限制性内切酶ApaⅠ、PstⅠ消化后，连接消化产物得到重组质粒。
[0010]在上述技术方案中，步骤3)将得到的重组质粒转化大肠杆菌复制得到大量的重组质粒。
[0011]在上述技术方案中，所述步骤1)中PCR扩增采用的引物为PAK1
‑
F/PAK1
‑
R，引物序列为：
[0012]PAK1
‑
F：5
’‑
AGCTCAACTATGATCTTTTT
‑3’
，
[0013]PAK1
‑
R：5
’‑
GAATATTTTCATCTCCTTTT
‑3’
。
[0014]本专利技术的另一目的是提供一种利用真核表达系统进行重组人PAK1蛋白表达的方法，在前述的构建方法基础上，还包括如下步骤：
[0015]4)利用步骤3)获得的人PAK1蛋白的真核表达载体的正确重组子扩增纯化得到的质粒转染进入真核细胞中进行表达。
[0016]优选地，步骤4)所述真核细胞包括用于外源基因表达的CHO细胞、COS
‑
7 细胞、NSO细胞、酵母、昆虫细胞及人源细胞，所述转染采用脂质体法转染。
[0017]本专利技术的再一目的是提供一种获得重组人PAK1蛋白的方法，在前述的方法步骤基础上，还包括步骤5)：
[0018]5)将步骤4)得到的阳性克隆进行培养扩大体系，收集培养细胞，破碎细胞，离心后收集上清，通过色谱柱将目的蛋白纯化，即获得高纯度重组人PAK1蛋白。
[0019]优选地，所述步骤5)中，收集培养细胞，采用超声破碎法破碎细胞，离心后收集上清，使用Ni柱进行亲和层析。
[0020]本专利技术的最后的目的是提供一种重组人PAK1蛋白的真核表达体系，是采用前述的方法构建得到的人PAK1蛋白的真核表达载体转染真核细胞得到的表达体系，所述真核细胞选自用于外源基因表达的CHO细胞、COS
‑
7细胞、NSO细胞、酵母、昆虫细胞及人源细胞。
[0021]专利技术人认为现有技术利用原核系统进行蛋白表达过程中，由于缺乏与天然 PAK1蛋白相同的表达环境导致重组的PAK1蛋白与天然PAK1蛋白结构有差异之处，导致制备出来的单抗存在识别天然PAK1蛋白特异性差和灵敏度低的缺点。为此我们选择真核表达系统模拟天然PAK1蛋白的表达环境可选用CHO等真核表达系统进行人PAK1蛋白表达、纯化。CHO表达系统具有以下的优点：
[0022](1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
[0023](2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
[0024](3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
[0025](4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
[0026](5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
[0027]本专利技术中所指真核表达载体是具有可以携带基因片段并可以通过调控元件在真核表达系统调控表达携带基因片段的分子生物学载体工具，更进一步的说是可以通过信号肽进行分泌或不带有信号肽进行胞内表达的载体或者可以通过包装病毒进行感染宿主细胞将携带基因整合到宿主基因组而进行该基因表达的载体；本专利技术不限制选择使用真核表达载体。本专利技术中指述的真核表达体系是可以适合外源基因表达的所有真核细胞，本专利技术不限制选择使用宿主细胞。
[0028]本专利技术的有益效果是：利用本专利技术的真核表达系统克服了原核表达的缺点，获得了高活性的重组人PAK1蛋白，且经过本专利技术方法纯化后的蛋白纯度高，纯度达到95％以上，本专利技术方法获得的重组人PAK1蛋白与天然PAK1蛋白结构相同，采用本专利技术方法获得的重组人PAK1蛋白制备出来的单抗识别天然PAK1蛋白特异性高、且灵敏度高，为获得高质量抗体提供了有力的基础。
具体实施方式
[0029]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各实施例中所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，均可通过商购获得。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)以表达PAK1蛋白的基因序列为模板，采用PCR扩增获得PAK1基因片段；2)将步骤1)得到的PAK1基因片段连接到真核表达载体上得到重组质粒；3)将得到的重组质粒进行转染转化复制，得到人PAK1蛋白的真核表达载体。2.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤2)中所述真核表达载体为pcDNA3.1，将将步骤1)得到的PAK1基因片段和pcDNA3.1分别采用限制性内切酶BamHI、EcoRI消化后，连接消化产物得到重组质粒。3.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤2)中所述真核表达载体为pCMV
‑
blank，先将步骤1)得到的PAK1基因片段采用T载体克隆，鉴定测序正确的克隆质粒与pCMV
‑
blank分别采用限制性内切酶ApaⅠ、PstⅠ消化后，连接消化产物得到重组质粒。4.如权利要求1所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：步骤3)将得到的重组质粒转化大肠杆菌复制得到大量的重组质粒。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的人PAK1蛋白的真核表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中PCR扩增采用的引物为PAK1
‑
F/PAK1
‑
R，引物序列为：PAK1
‑
F：5
’‑
AGCTCAACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张浩洋，石坚，徐爱华，朱国方，
申请(专利权)人：绍兴守仁医疗健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：