牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及食品检验技术领域，公开了一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，将beef基因与ref基因串联得beef

【技术实现步骤摘要】
牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及食品检验
，具体涉及牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用。

技术介绍

[0002]我国及欧盟食品标准均要求肉制品包装中应明确标识产品中动物源成分组成及含量，但市场上肉制品中动物源性成分含量虚标、掺假事件屡禁不止。肉制品掺假给消费者的身体健康(过敏反应)、宗教信仰等方面均带来了风险。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分定性、定量鉴别技术的研究成为食品安全领域的研究热点。
[0003]目前使用的动物源性成分鉴定分析方法主要基于蛋白质和DNA分析。蛋白质分析技术包括免疫、色谱和质谱，肉制品加工过程中的热处理工艺、酸碱盐环境变化使蛋白质变性，生物活性丧失，很难满足检测的需要，且亲缘关系较近的物种蛋白质分析易出现交叉反应，限制了蛋白质分析技术在这一领域的应用。基于DNA分析的检测方法可以克服这些困难，DNA的热稳定性、酸碱稳定性优于蛋白质，并且DNA有更丰富的种间多态性，高温处理过的食品中仍能提取出片段化的DNA，在深加工肉制品的鉴别检测中DNA分析方法具有灵敏度高和特异性强的明显优势。但现行标准中的检测方法主要存在以下局限性：第一，只能进行定性检测，无法完成定量分析；第二，检测灵敏度过高，在检测过程中，无法排除在生产、储存、运输、销售等过程中样品交叉污染或原料带入所带来的阳性结果，很难为市场监管提供有力的技术支撑。
[0004]现行检测技术无法定量分析样品中动物源性成分的根本原因在于检测使用的引物和探针是针对线粒体基因设计的。线粒体基因进化速度快，对物种的区分度较高，常用于物种的细致分类，研究生物的进化过程。但是，线粒体基因在不同组织细胞中拷贝数不同，因此针对线粒体DNA的检测方法只能进行定性检测，无法完成定量分析；线粒体的拷贝数普遍较高，以线粒体基因作为检测靶位进行检测时灵敏度过高，在检测过程中，无法区分产品交叉污染、原料带入和生产者恶意掺假造成的阳性检测结果。以细胞核染色体基因组中单拷贝基因作为检测靶位设计引物和探针，建立动物源性成分定量分析方法，可以克服现有定性检测方法的缺点。但已报道的定量分析方法存在以下不足，严重限制了这些方法的推广应用。第一，用于定量的基因拷贝数与样品质量分数之间的对应关系无法准确计算；第二，以质量分数计算样品中牛肉含量时要求DNA提取效率接近100％，但由于不同肉制品肉源性成分、加工工艺、原辅料不同，DNA提取效率很难达到100％；第三，定量过程需要绘制标准曲线，但无法获得定量准确的标准品。因此，建立基于细胞核染色体基因组中单拷贝基因的相对定量Q
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PCR方法对肉制品中动物源性成分进行定量分析，准确鉴别肉制品掺假，可为市场监管、执法检验提供可靠的技术支撑。

技术实现思路

[0005]基于以上问题，本专利技术提供牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应
用，本专利技术可满足牛肉制品掺假鉴别的检测需求，有效区分交叉污染、原料带入和恶意掺假，为市场监管提供了有力的技术支撑，进一步保障了肉制品食品安全。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef
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ref基因，beef
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ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef
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ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef
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ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。
[0008]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了标准质粒。
[0009]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：
[0010]S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
[0011]S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：
[0012][0013]之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：
[0014]p％＝b
t
÷
r
t
×
100
[0015]其中p％为样品中牛肉成分含量；b
t
为样品中beef基因绝对拷贝数；r
t
为样品中ref基因绝对拷贝数。
[0016]进一步的，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。
[0017]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了利用标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，包括如下步骤：
[0018]S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；
[0019]S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102‑
108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0020]PCR扩增体系
[0021][0022]PCR扩增程序
[0023][0024]S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT
‑
PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O 7μl；扩增程序见下表：
[0025][0026][0027]之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：
[0028]p％＝k
×
(b
t
÷
r
t
)
×
100
[0029]其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；b
t
为样品中beef基因绝对拷贝数；r
t
为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，其特征在于，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef
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ref基因，beef
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ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef
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ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef
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ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。2.权利要求1所述的制备方法制备的标准质粒。3.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH2O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：p％＝b
t
÷
r
t
×
100其中p％为样品中牛肉成分含量；b
t
为样品中beef基因绝对拷贝数；r
t
为样品中ref基因绝对拷贝数。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。5.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成102‑
108拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；PCR扩增体系
PCR扩增程序S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT
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PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH2O...

【专利技术属性】
技术研发人员：马炳存，陈学强，李琰歆，贺巧玲，曹乾超，王灿，崔学文，刘阳，李增婷，
申请(专利权)人：四川省食品药品检验检测院四川省药品质量研究所，四川省医疗器械检测中心，
类型：发明
国别省市：