一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用，该灰树花小肽铁螯合物的制备包括如下步骤:(1)灰树花子实体蛋白提取；(2)灰树花蛋白酶解；(3)灰树花蛋白肽的分离纯化；(4)灰树花小肽铁螯合物的制备。本发明专利技术以灰树花子实体提取灰树花蛋白，通过酶解获得小肽，分离纯化后与铁盐螯合制得灰树花肽铁螯合物，该肽铁螯合物的铁生物利用度优于无机盐铁，并具有较强的免疫活性。本发明专利技术制得的灰树花小肽铁螯合物性质稳定，易溶于水，该小肽铁螯合物较传统的口服铁剂硫酸亚铁对胃肠道的损伤小，且能够被更好地吸收，可以作为新型的补铁剂。本发明专利技术制备工艺简便快捷，且合成的多肽铁螯合物效率高，螯合的铁含量高。

A Grifola frondosa small peptide iron chelate and its preparation method and Application

The invention discloses a Grifola frondosa small peptide iron chelate and its preparation method and application. The preparation of Grifola frondosa small peptide iron chelate comprises the following steps: (1) extraction of Grifola frondosa fruit body protein; (2) hydrolysis of Grifola frondosa protease; (3) separation and purification of Grifola frondosa protein peptide peptide; (4) preparation of Grifola frondosa small peptide iron chelate. Grifola frondosa protein is extracted from Grifola frondosa fruiting body, small peptide is obtained by enzymatic hydrolysis, iron chelate of Grifola frondosa peptide is prepared by separation and purification and chelation with iron salt. The iron bioavailability of the iron chelate of Grifola frondosa peptide is better than that of inorganic salt iron, and it has strong immune activity. The Grifola frondosa small peptide iron chelate prepared by the invention is stable in nature and soluble in water. Compared with the traditional oral iron agent ferrous sulfate, the small peptide iron chelate has less damage to the gastrointestinal tract and can be better absorbed, and can be used as a new iron supplement. The preparation process of the polypeptide iron chelate is simple and fast, and the synthesized polypeptide iron chelate has high efficiency and high iron content.

【技术实现步骤摘要】
一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法和应用。
技术介绍
灰树花(Grifolafrondosa)是珍稀食药两用菌之一，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花菌属真菌，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、重菇、云覃、莲花菌等，日本称之舞茸(Maitake)。野生灰树花多生长于亚热带至温带森林中，日本、俄罗斯、北美及中国长白山地区、河北、四川等地广泛分布。灰树花子实体味道鲜美、具有松茸的浓香，同时具有很高的营养和保健价值。灰树花中糖类含量最高，其中的蛋白含量仅次于多糖，且蛋白含量比香菇、金针菇、木耳等菌类中的更高。子实体中含17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸，占灰树花氨基酸总量的40.0％。灰树花子实体中异亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)含量较高，对保持浓郁的鲜味、促进与金属离子的螯合、缓解疲劳、保护人脑神经等具有重要作用。灰树花不仅营养丰富，而且具有一定的保健功能。但是对于灰树花的研究多停留在多糖提取及其生物学功能方面，而灰树花多肽具有抗氧化、免疫增强、抗肿瘤等功能活性，目前关于灰树花蛋白质及其衍生物的研究鲜见报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种灰树花小肽铁螯合物及其制备方法，本专利技术以灰树花子实体提取灰树花蛋白，通过酶解获得小肽，分离纯化后与铁盐螯合制得灰树花肽铁螯合物，该肽铁螯合物的铁生物利用度优于无机盐铁，并具有较强的免疫活性。本专利技术还提供灰树花小肽铁螯合物的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)灰树花子实体蛋白提取：将干燥的灰树花子实体粉碎制成灰树花子实体超微粉，加入蒸馏水，搅拌均匀后，恒温搅拌提取，结束后，冷却至室温，离心，取上清液，低温静置过夜，离心倾去上清液，沉淀洗涤，真空干燥粉碎，过筛，即得灰树花子实体蛋白粉；(2)灰树花蛋白酶解：称取灰树花子实体蛋白粉，加入蒸馏水，再加入蛋白酶，进行酶解，结束反应后水解液离心，取上清液经透析，冻干得到粗灰树花蛋白肽，保存；(3)灰树花蛋白肽的分离纯化：对得到的粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化；超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化得到灰树花多肽；(4)灰树花小肽铁螯合物的制备：称取灰树花多肽，加入蒸馏水溶解后，再加入的抗坏血酸溶液，再加入FeCl2溶液，振荡反应，反应结束后离心，取上清加入无水乙醇，过夜沉淀，离心取沉淀，洗涤后干燥，得到灰树花小肽铁螯合物。其中，步骤(1)所述取上清液后先将上清液蒸发至原体积的1/2，用调pH值至3.5灰树花蛋白等电点。其中，步骤(2)所述蛋白酶为风味酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种。其中，步骤(2)所述蛋白酶的加入量为1600-2100U/g灰树花子实体蛋白粉。作为优选，步骤(2)所述酶解时间为1-3.5h。最优选的，采用碱性蛋白酶水解灰树花蛋白最佳工艺条件为pH9、加酶量1800U/g灰树花子实体蛋白粉、酶解温度55℃、灰树花蛋白浓度0.5g/100mL、酶解时间2.5h。本专利技术在最佳酶解条件下，亚铁螯合能力为(1.854±0.025)mg/g，水解度为(6.14±0.05)％。其中，步骤(3)所述粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化为粗灰树花蛋白肽配制成溶液，过滤，得到上清液，将溶液经超滤后透析，冻干得到大于5KDa,1-5KDa和小于1KDa的灰树花多肽组分。其中，步骤(3)所述超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化为通过将葡聚糖凝胶粉加入蒸馏水中充分溶胀，去除悬浮颗粒进行脱气处理；将脱气处理的葡聚糖凝胶溶液加入到层析柱中，用PBS缓冲液作为流动相，将超滤后不同分子量灰树花多肽进行上样洗脱，从而得到纯化组分灰树花多肽。其中，步骤(4)中每100mg灰树花多肽，加入100-120μL抗坏血酸溶液；加入100-120μLFeCl2溶液；振荡反应温度为20-25℃、反应4-5min。最优选的，螯合反应的最佳工艺条件为：每100mg灰树花多肽，当pH为5、反应体系总体积为10mL，加入1mol/L的100μL氯化亚铁、温度为20℃、反应5min，在此条件下得到的螯合物铁含量最高，为(31.51±1.32)mg/g。本专利技术所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法所制备的灰树花小肽铁螯合物。本专利技术所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法所制备的灰树花小肽铁螯合物在制备生物活性补铁剂中的应用。本专利技术中的试剂均市售可得，碱性蛋白酶(200U/mg)、中性蛋白酶(14000U/g)、胃蛋白酶(15000U/g)、复合蛋白酶(120U/mg)、风味蛋白酶(20U/mg)购买于上海源叶生物有限公司；胰蛋白酶(2500U/g)阿拉丁试剂公司；SephadexG-25、SephadexG-15北京索莱宝科技有限公司。双抗：(青霉素100U/mL,链霉素0.1mg/mL)；非必需氨基酸:(L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天(门)冬酰胺、L-天(门)冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸)；胎牛血清、非必需氨基酸溶液、MEM培养液购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合溶液购于碧云天生物技术有限公司。本专利技术所用材料为灰树花，其蛋白含量仅次于多糖。灰树花子实体蛋白中含17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸，占灰树花氨基酸总量的40.0％。灰树花子实体中异亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)含量较高，对保持浓郁的鲜味、促进与金属离子的螯合、缓解疲劳、保护人脑神经等具有重要作用。酶解灰树花蛋白得到的灰树花多肽通常具有一定的生物活性，且易于被人体消化吸收、抗原性较低等特质。利用灰树花多肽合成的多肽铁螯合物为棕色粉末，无异味，无游离铁离子，易溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，性质稳定。该多肽铁螯合物可被动物体以分子形式吸收，并靶向到特定组织释放铁元素，补铁的同时也减少了游离铁离子产生的内源性自由基对细胞膜造成损伤的情况。此外，人体免疫系统与铁缺乏息息相关，该灰树花多肽铁可有效促进机体免疫系统的增强。该专利技术所制备的灰树花小肽铁螯合物性质稳定，安全性高，易于吸收且具有一定的生物活性。本专利技术不仅为促进药食同源菌类的产业和资源高效利用提供了新的研究方向，也为肽铁螯合物的制备提供了原料。本专利技术探究了灰树花蛋白肽铁螯合物的制备工艺、基本结构以及其吸收机制，并研究了灰树花多肽及其铁螯合物的免疫活性，为灰树花蛋白肽铁作为安全有效的具有一定生物活性的功能性食品添加剂提供了依据，同时提升了灰树花的经济和社会价值。本专利技术对灰树花蛋白肽及其铁螯合物进行紫外和红外光谱扫描，图谱表明，灰树花蛋白肽及其铁螯合物均具有氨基酸的特征吸收。但螯合物紫外最大吸收峰发生蓝移，且红外光谱中峰数、峰强和峰的位置均发生改变并出现N-Fe吸收峰，表明生成了灰树花肽铁螯合物，同时阐明了其螯合机制为：铁与氨基和羧基均有结合。本专利技术通过体外消化实验表明，GFP-Fe可在胃肠道中保持较高的溶解度和稳定性。且在肠道环境中,GFP-Fe溶解度比FeSO4更高可更好促进小肠对GFP-Fe的吸收。细胞毒性实验结果证明，GFP-Fe与FeSO4相比毒性较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)灰树花子实体蛋白提取：将干燥的灰树花子实体粉碎制成灰树花子实体超微粉，加入蒸馏水，搅拌均匀后，恒温搅拌提取，结束后，冷却至室温，离心，取上清液，低温静置过夜，离心倾去上清液，沉淀洗涤，真空干燥粉碎，过筛，即得灰树花子实体蛋白粉；(2)灰树花蛋白酶解：称取灰树花子实体蛋白粉，加入蒸馏水，再加入蛋白酶，进行酶解，结束反应后水解液离心，取上清液经透析，冻干后得到粗灰树花蛋白肽，保存；(3)灰树花蛋白肽的分离纯化：对得到的粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化；超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化得到灰树花多肽；(4)灰树花小肽铁螯合物的制备：称取灰树花多肽，加入蒸馏水溶解后，再加入的抗坏血酸溶液，再加入FeCl2溶液，振荡反应，反应结束后离心，取上清加入无水乙醇，过夜沉淀，离心取沉淀，洗涤后干燥，得到灰树花小肽铁螯合物。

【技术特征摘要】
1.一种灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)灰树花子实体蛋白提取：将干燥的灰树花子实体粉碎制成灰树花子实体超微粉，加入蒸馏水，搅拌均匀后，恒温搅拌提取，结束后，冷却至室温，离心，取上清液，低温静置过夜，离心倾去上清液，沉淀洗涤，真空干燥粉碎，过筛，即得灰树花子实体蛋白粉；(2)灰树花蛋白酶解：称取灰树花子实体蛋白粉，加入蒸馏水，再加入蛋白酶，进行酶解，结束反应后水解液离心，取上清液经透析，冻干后得到粗灰树花蛋白肽，保存；(3)灰树花蛋白肽的分离纯化：对得到的粗灰树花蛋白肽通过超滤进行第一步纯化；超滤纯化后通过葡聚糖凝胶柱进行分离纯化得到灰树花多肽；(4)灰树花小肽铁螯合物的制备：称取灰树花多肽，加入蒸馏水溶解后，再加入的抗坏血酸溶液，再加入FeCl2溶液，振荡反应，反应结束后离心，取上清加入无水乙醇，过夜沉淀，离心取沉淀，洗涤后干燥，得到灰树花小肽铁螯合物。2.根据权利要求1所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述取上清液后先将上清液蒸发至原体积的一半，调pH值至灰树花蛋白等电点。3.根据权利要求1所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白酶为风味蛋白酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种。4.根据权利要求1所述的灰树花小肽铁螯合物的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈贵堂，程晨，赵聪，袁彪，曹崇江，程抒劼，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32