一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种产转糖基活性β‑半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法，产转糖基活性β‑半乳糖苷酶的菌株分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLBGNL‑S7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018397，保藏日期为2018年6月25日。本发明专利技术植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLBGNL‑S7菌株来源于奶酪，安全性及遗传稳定性好，生长快，培养简单，产β‑半乳糖苷酶水平高；以此菌为发酵菌株发酵生产β‑半乳糖苷酶的酶活可达1‑157U/mL；将得到的β‑半乳糖苷酶酶液添加到30％(w/v)乳糖溶液中催化反应合成低聚半乳糖，转化反应2‑24h，反应产物GOS得率可达43.40％(w/w)，其中转移二糖和转移三糖分别为18.29％(w/w)和12.95％(w/w)。

A strain producing transglycosyl active beta-galactosidase and the method of producing galactoligosaccharide with this enzyme

The invention discloses a strain producing transglycosyl active beta galactosidase and a method for producing oligosaccharide with the enzyme. The strain producing transglycosyl active beta galactosidase is classified as Lactobacillus plantarum YLBGNL_S7, which is stored in a typical culture preservation center in China. The preservation number is CCTCC M 20197 and the preservation date is June 25, 2018. \u3002 The Lactobacillus plantarum strain YLBGNL S7 of the invention originates from cheese, has good safety and genetic stability, fast growth, simple culture and high level of producing beta galactosidase; the fermentation activity of producing beta galactosidase by using the strain as fermentation strain can reach 1 157U/mL; and the obtained beta galactosidase solution is added to 30% (w/v) lactose solution to catalyze the reaction. The yield of GOS was 43.40%(w/w) when galactoligosaccharides were synthesized and converted for 2_24 H. Among them, 18.29%(w/w) and 12.95%(w/w) were transfered disaccharides and transfered trisaccharides, respectively.

【技术实现步骤摘要】
一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
本专利技术涉及食品生物
，特别是一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法。
技术介绍
低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，GOS)是一类不可被人体肠道消化吸收的功能性低聚糖。低聚半乳糖具有调整改善肠道菌群，促进人体健康的功效。低聚半乳糖对双歧杆菌等益生菌具有显著的增殖作用，其益生特性获得了广泛的临床验证，益生指数(PI)高达11.66，显著高于相同糖链单元低聚果糖(FOS)的PI值5.05。此外，低聚半乳糖还具有降低结肠癌风险，减少炎症，减少肠道病原体侵袭，提高宿主免疫力等功效。低聚半乳糖的加工性能较好，具有低分子量水溶性膳食纤维的特点，热值较低，甜度为蔗糖的20-40％，对酸和热较稳定，作为一种天然存在的人乳寡糖(HMOS)，低聚半乳糖可应用于婴儿配方奶粉，成为人乳寡糖(HMOS)在新生儿和婴儿配方奶粉中的替代品，是近年来倍受关注的功能性低聚糖。低聚半乳糖的结构与人乳寡糖(HMOS)近似，由数量不等的半乳糖单元，以葡萄糖或半乳糖单元为还原性末端，通过β-(1-4)，β-(1-6)、β-(1-3)等β-糖苷键构成的异质性低聚糖。结构分析鉴定发现的转移二糖、转移三糖、转移四糖形式的低聚半乳糖超过30种。不同结构及聚合度的低聚半乳糖，其益生特性也存在差异。作为膳食补充剂的低聚半乳糖，商业化生产主要以各种原料形式的乳糖，利用微生物来源的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)通过酶法合成。国际上用于低聚半乳糖合成的工业化酶制剂产品仅仅局限于米曲霉(Aspergillusoryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)来源的β-半乳糖苷酶。尽管已有上述不同来源β-半乳糖苷酶合成的低聚半乳糖产品上市，但酶法合成低聚半乳糖仍存不足：(1)低聚半乳糖的得率较低、乳糖转化率不高。目前商业化低聚半乳糖产品(丹麦FrieslandFoodDomo的和日本YakultHonsha的)中实际上仍含有20％左右的乳糖和葡萄糖。为了获得高纯度的低聚半乳糖，酶法合成的低聚半乳糖还需经过色谱、膜分离或微生物发酵转化等方式进行下游纯化处理；(2)低聚半乳糖产品的同质化严重。酶的来源直接影响酶法合成低聚半乳糖的结构和益生特性，不同来源β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖产物谱存在显著差异，其低聚半乳糖产物主要成分的糖苷键类型以及聚合度也不同。基于上述原因，筛选转糖基活性更高，转糖基反应产物益生指数更高的β-半乳糖苷酶成为近年的研究热点。国内外研究者先后从不同样品来源的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、以及不同来源的婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、两岐双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜热链球菌菌(Streptococcusthermophilus)等乳酸菌菌株中筛选具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶。然而，研究表明不同属、不同种及不同菌株来源β-半乳糖苷酶的活性及转糖基反应产物都存在差异。B.adolescentis来源的β-半乳糖苷酶(BgbⅡ)偏好形成β-(1-4)糖苷键的转半乳糖基产物，而不生成β-(1-6)糖苷键的转半乳糖基产物(Hinzetal.2004)，B.bifidum来源的β-半乳糖苷酶(BgbⅡ)则明显偏好形成β-(1-6)糖苷键的转半乳糖基产物(Goulasetal.2009)。基于乳杆菌属菌株基因组学的研究也证明，乳杆菌属菌株基因组具有复杂的多样性(张和平等2016)，不同环境来源的相同种属乳杆菌的代谢特点与其生活环境密切相关，特别是一些碳水化合物代谢相关蛋白的基因在乳杆菌属不同种菌株之间存在较大的差异。已有来源于人唾液L.plantarumWCFS1及来源于泡菜L.plantarum70810合成GOS的报道，但来源于奶酪的乳源L.plantarum合成GOS的报道还未出现。
技术实现思路
本专利技术的目的是要解决现有技术中产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株产酶水平较低低聚半乳糖产品存在的同质性问题，提供一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法，以植物乳杆菌YLBGNL-S7产生的β-半乳糖苷酶可以较高的转化率，以乳糖为底物催化合成以转移二糖、转移三糖为主的低聚半乳糖产物。为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：本专利技术的第一个目的是提供一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YLBGNL-S7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2018397，保藏日期为2018年6月25日。本专利技术的第二个目的是提供一种发酵生产β-半乳糖苷酶的方法，用上述产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，具体步骤如下：(1)种子培养种子培养基：乳糖5-20g，蛋白胨1-10g，牛肉浸粉1-10g，酵母浸粉1-5g，K2HPO45g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O0.58g，吐温-801-4mL，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL配制，pH6.3，并于121℃下灭菌20min；种子培养条件：将植物乳杆菌YLBGNL-S7于30-38℃、100-250rpm的转速震荡培养10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基：乳糖5-20g，蛋白胨1-10g，牛肉浸粉1-10g，酵母浸粉1-5g，MgSO4·7H2O0.58g，吐温-801-4mL，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL配制，pH6.3，121℃灭菌20min；发酵条件：植物乳杆菌YLBGNL-S7的接种量为发酵培养基的1％-10％，在30-38℃、震荡转速100～300rpm发酵培养12-24h生产β-半乳糖苷酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集湿菌体，用pH6.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液制成菌悬液，然后于0℃冰浴条件下超声破碎，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液，经检测酶活达到10-157U/mL。进一步，一种发酵生产β-半乳糖苷酶的方法，用上述产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，具体步骤可以如下：(1)种子培养种子培养基：乳糖5-20g，蛋白胨1-10g，牛肉浸粉1-10g，酵母浸粉1-5g，K2HPO45g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O0.58g，吐温-801-4mL，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL配制，pH6.3，并于121℃下灭菌20min；种子培养条件：将植物乳杆菌YLBGNL-S7于30-38℃、100-250rpm的转速震荡培养10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产转糖基活性β‑半乳糖苷酶的菌株，其特征在于：其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YLBGNL‑S7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018397，保藏日期为2018年6月25日。

【技术特征摘要】
1.一种产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，其特征在于：其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YLBGNL-S7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2018397，保藏日期为2018年6月25日。2.一种发酵生产β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，用如权利要求1所述的产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，具体步骤如下：(1)种子培养种子培养基：乳糖5-20g，蛋白胨1-10g，牛肉浸粉1-10g，酵母浸粉1-5g，K2HPO45g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O0.58g，吐温-801-4mL，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL配制，pH6.3，并于121℃下灭菌20min；种子培养条件：将植物乳杆菌YLBGNL-S7于30-38℃、100-250rpm的转速震荡培养10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基：乳糖5-20g，蛋白胨1-10g，牛肉浸粉1-10g，酵母浸粉1-5g，MgSO4·7H2O0.58g，吐温-801-4mL，MnSO40.25g，蒸馏水1000mL配制，pH6.3，121℃灭菌20min；发酵条件：植物乳杆菌YLBGNL-S7的接种量为发酵培养基的1％-10％，在30-38℃、震荡转速100～300rpm发酵培养12-24h生产β-半乳糖苷酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集湿菌体，用pH6.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液制成菌悬液，然后于0℃冰浴条件下超声破碎，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液，经检测酶活达到10-157U/mL。3.一种发酵生产β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，用如权利要求1所述的产转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，具体步骤如下：(1)种子培养种子培养基：乳糖5-20...

【专利技术属性】
技术研发人员：关波，胡有贞，倪永清，张艳，王丽军，牟元珍，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65