高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用技术

本发明专利技术属微生物技术领域，提供高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用。从山西老陈醋发酵过程中分离、筛选出1株产乙偶姻、产香、产多酚能力均较强的莫海威芽孢杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 16910。将增香莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，最终新淋醋中川芎嗪266.47μg/mL、多酚514μg/mL，生理功能成分显著提高，总酸、不挥发性酸及总酯的含量也显著提高，与对照相比分别提高了59.04%、77.89%、74.32%，并且还丰富了挥发性香气谱图及含量。

Preparation of High Yield Ethyl Couple Marriage and Flavor-Enhancing Bacillus Mohaiwei Direct Input Fermentation Agent and Its Application in Shanxi Old Vinegar Production

The invention belongs to the field of microbial technology, and provides the preparation method of high-yielding ethicomarin and fragrant Bacillus mohawii direct-feeding starter and its application in the production of Shanxi aged vinegar. A strain of Bacillus Mohaiwei with strong ability of producing ethyl-conjugate, aroma and polyphenols was isolated and screened from the fermentation process of Shanxi vinegar. It was stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee, and its storage number was CGMCC 16910. In the production of Shanxi aged vinegar, Ligustrazine 266.47 ug/mL and polyphenol 514 ug/mL in Xinlin vinegar were used as the direct-input starter of Bacillus Mohaiwei CGMCC 16910. The contents of physiological function components, total acid, non-volatile acid and total ester were significantly increased, which were 59.04%, 77.89% and 74.32% higher than those of the control, respectively, and the volatile aroma spectrum was also enriched. Figure and content.

【技术实现步骤摘要】
高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用。
技术介绍
山西老陈醋以优质高梁为主要原料，大曲为发酵剂，采用传统自然固体发酵并结合独特熏、淋、晒等工艺，形成老陈醋独特的酸、绵、香、甜风味与口感。老陈醋的独特风味得益于其天然发酵过程中微生物菌群的生长代谢及复杂的协同作用，这些微生物代谢产生丰富的酶类、风味、滋味及其他生理功能（抗氧化、降血压等）物质。除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陈醋发酵生产过程中的重要微生物种群，其在糖化酶和蛋白酶产生、风味贡献、功能活性物质生成（乙偶姻-川芎嗪重要前体物质，多酚等）、抑制杂菌等具有重要意义。乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川芎嗪的前体物质。目前，关于微生物发酵体系中川芎嗪的生成机制主要存在两种观点，其一是由微生物经糖代谢产生乙偶姻，乙偶姻继续被微生物细胞中的酶催化生成川芎嗪；其二是微生物发酵体系中的乙偶姻和氨化学反应合成川芎嗪。为了提高陈醋中川芎嗪的含量，一些学者进行了产乙偶姻菌种的筛选工作，包括酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌，研究证明芽孢菌的乙偶姻产量及稳定性显著优于其他菌种。研究表明，山西老陈醋酒精发酵过程中，芽孢菌可以生成具有水果香味的乙酸乙酯、具有菠萝香味的庚酸乙酯、带有花生香气的十二酸乙酯等特征风味物质；在醋酸发酵阶段，芽孢菌代谢产生的乳酸、苹果酸、酒石酸、丙酮酸等有机酸，一方面能缓冲乙酸带来的强烈刺激性酸味，另一方面可以与醇类物质酯化生成酯类物质，丰富老陈醋味感与口感。关于产香和产四甲基吡嗪（川芎嗪）芽孢菌的应用，目前主要集中在酒类酿造中。2016年王婧等人将产四甲基吡嗪的功能芽孢杆菌FBKL1.0199和FBKL1.0201添加到粹沙酱香型白酒的生产中，结果发现，与未加入功能性芽孢杆菌的对照组进行对比，粹沙酱香型白酒中四甲基吡嗪含量明显提高，且酒质清亮透明，酒体协调，苦味较少，酱香风味突出。关于食醋酿造过程中芽孢菌的开发应用研究较少。本专利技术主要是从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，并将其制备成直投式发酵剂应用在传统食醋生产中，对于提高山西老陈醋的营养生理功能和丰富风味具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术涉及一种高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用。本专利技术的技术方案如下：高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的50株芽孢菌进行产乙偶姻能力的测定；再对产乙偶姻能力排在前3位的芽孢菌产多酚、产酯、有机酸及挥发性香气成分的种类和含量进行测定，从中筛选出一株高产乙偶姻及增香的山西老陈醋土著芽孢菌15，乙偶姻产量为45.63g/L，多酚产量为453.00μg/mL，在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中产酯量分别为8.53g/100mL、7.61g/100mL，有机酸总量分别为0.5177g/L、1.3406g/L。高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌15的鉴定：对芽孢菌15进行形态学和16SrDNA测序鉴定，采用的引物为：上游：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′下游：5′-CGACTTCACCCAATCATCTG-3′，经鉴定为莫海威芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年12月10日，保藏编号：CGMCC16910。莫海威芽孢杆菌CGMCC16910的菌落及细胞形态特征为：在MRS平板培养基上形成菌落直径4.80mm，菌落边缘不整齐、表面粗糙且褶皱明显、半透明、干燥、中间凸起呈脊状、有黏度、浅黄色；其细胞形态：革兰氏染色呈G+，呈杆状，中间有芽孢。莫海威芽孢杆菌CGMCC16910直投式发酵剂的制备方法：将活化后的莫海威芽孢杆菌CGMCC16910按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃，180r/min培养24h后，菌体浓度达到108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩莫海威芽孢杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3（v:v）混合，低温喷雾干燥（进风温度为120℃，出风温度为55℃），至水分含量为≤5%时，真空包装即为莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂，其活菌数为1010cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。将莫海威芽孢杆菌CGMCC16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中的具体方法为：高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤温度为50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤温度为80℃的水搅拌均匀，温度降至25‒33℃时拌入60公斤的大曲，加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的直投式发酵剂（1g直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵；酒精度为6%时，加入200公斤麸皮和160公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（上一批发酵第2天的醋醅），再加入高粱重量0.5%的已经活化处理好的直投式发酵剂，控制发酵罐内温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。采用增香莫海威芽孢杆菌CGMCC16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，最终新淋醋中川芎嗪（266.47μg/mL）、多酚（514μg/mL）等生理功能成分显著提高，并且总酸、不挥发性酸及总酯的含量也显著提高，与对照相比分别提高了59.04%、77.89%、74.32%，另外，还丰富了挥发性香气谱图及含量。附图说明图1为莫海威芽孢杆菌CGMCC16910的菌落形态和细胞形态图，图中A为莫海威芽孢杆菌CGMCC16910的菌落形态图；B为莫海威芽孢杆菌CGMCC16910在1000×下的细胞形态图；图2为莫海威芽孢杆菌CGMCC16910的16SrDNA系统发育树。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。实施例1：高产乙偶姻、多酚及增香芽孢菌的筛选（1）高产乙偶姻芽孢菌的筛选：分别采集山西老陈醋酒精发酵阶段的酒醪样品和醋酸发酵阶段的醋醅样品，采用MRS培养基进行稀释涂布，最终共分离出50株芽孢菌。采用Voges-Proskauer(V-P)反应和分光光度法对其产乙偶姻能力进行测定，其中芽孢菌15产乙偶姻最高，为45.63g/L；其次是芽孢菌297（40.52g/L）和芽孢菌2030（40.28g/L）。上述的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K2HPO42g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温801mL，MgSO40.2g，MnSO40.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。上述测定乙偶姻的Voge本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年12月10日，保藏编号：CGMCC16910。2.根据权利要求1所述的一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株的菌落及菌体特征为：在MRS平板培养基上形成菌落直径4.80mm，菌落边缘不整齐、表面粗糙且褶皱明显、半透明、干燥、中间凸起呈脊状、有黏度、浅黄色；其细胞形态：革兰氏染色呈G+，呈杆状，中间有芽孢。3.根据权利要求1或2所述的一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌，其特征在于：所述莫海威芽孢杆菌CGMCC16910的乙偶姻产量为45.63g/L，多酚产量为453.00μg/mL，在高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中产酯量分别为8.53g/100mL、7.61g/100mL，有机酸总量分别为0.5177g/L、1.3406g/L。4.利用权利要求1或2所述的一株高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌制备直投式发酵剂，其特征在于：所述直投式发酵剂的具体制备方法为：将活化的莫海威芽孢菌CGMCC16910按照3%的接种量接入到MRS液体培养基中，37℃，180r/min培养24h后，菌体浓度达到108cfu/mL，采用中空纤维膜浓缩莫海威芽孢杆菌发酵液至原体积的1/5，浓缩发酵液中添加无菌保护剂，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃进行低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%，即为莫海威芽...

【专利技术属性】
技术研发人员：许女，陈旭峰，贾瑞娟，王如福，王佳丽，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14