用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法技术方案

本公开涉及一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑10所示的引物和SEQ ID NO.15‑23所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定。

Nucleic acid reagents, kits, systems and methods for detecting invasive fungi

The present disclosure relates to a nucleic acid reagent, kit, system and method for detecting invasive fungi, in which the nucleic acid reagent includes primers shown in SEQ ID NO.1_10 and probes shown in SEQ ID NO.15_23 stored independently or randomly mixed with each other, respectively. The present disclosure establishes nucleic acid reagents, kits, systems and methods for detecting invasive fungi through the primers and probes mentioned above, which can realize rapid, comprehensive, sensitive, specific and automatic determination of detection results.

【技术实现步骤摘要】
用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
本公开涉及生物
，具体地，涉及一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
技术介绍
真菌属于真核生物，广泛存在于自然界中，绝大部分真菌对人类是有利的，少数感染人类则会导致严重的疾病。根据感染部位的不同，真菌感染分为浅部真菌感染和深部真菌感染，绝大部分的侵袭性真菌感染属于深部真菌感染。近30年来，随着实体器官及造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)等技术的广泛开展、免疫抑制剂、放疗化疗的大量应用、导管介入及留置技术的广泛开展使患者机体免疫功能受损，侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，IFI)的发病率及死亡率在全球范围内显著上升,严重威胁人类健康。流行病学研究显示，院内真菌感染率7.5％，肿瘤病人发病率为8％，严重烧伤及创伤病人感染率达16％，病死率高达55％-70％。在美国，酵母菌血症已跃居院内血源性感染的第4位，而在中国IFI已成为院内感染第2位的重要组成。HIV病毒感染者，器官移植等免疫机制受损的患者感染肺孢子虫的概率大大增加，且容易出现混合感染。肺部常见的真菌感染有念珠菌、曲霉菌、新型隐球菌、毛霉菌及肺孢子虫感染。需要注意的是，绝大部分的侵袭性真菌在人体内均存在定植的情况，健康人体内也存在大量的真菌病原体，只有当人体免疫机制紊乱或者受到严重损害时，定植的真菌会转换为具有侵袭血管、消化道等器官的侵袭性真菌，从而引发多功能的损害，危及患者生命。因此，侵袭性真菌的诊断对于免疫功能受损的患者具有较大的临床价值。诊断侵袭性真菌病临床病原体的常规方法主要有镜检、培养、组织病理学检查、血清学方法及分子生物学方法。经典的培养法存在着检测周期长、敏感度低、技术条件要求高、操作人员专业要求高及检测目标单一的问题，难以应用于临床早期诊断及指导治疗。侵袭性真菌病的非培养实验室检测方法主要包括真菌抗原检测、真菌抗体血清学检测以及分子生物学检测。真菌抗原检测包括(1,3)-β-D-葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测、隐球菌荚膜多糖抗原检测以及念珠菌甘露聚糖抗原检测等。不同的抗原用于诊断不同的真菌感染。抗真菌抗体的血清学检测主要包括荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌/副球孢子菌以及皮炎芽生菌的相应血清抗体的检测。特殊检测中的血清学检测可以判断是否存在真菌感染，但是不能实现种水平的区分。面对如此严峻的感染现状，诊断及治疗面临挑战：新病原体的不断出现、病情恶化快、院感感染率和死亡率高、临床和实验室诊断率低造成超过95％的患者延迟治疗；由于抗真菌的药的广泛使用，一些病原体出现了耐药的现象，常见的抗真菌药物对不同属或者种治疗效果不同。因此实现早期快速多目标诊断有利于指导合理用药，提高患者生存率，对于监测病原谱的变化具有很大的意义。目前国内临床进行病原体检测方法大多数为常规检测及特殊检测。常规检测为镜检、培养基组织病理学检查，这几种方法阳性率低、假阴性无法排除；特殊检测中的血清学检测可以判断是否存在真菌感染，但是不能实现种水平的区分。近年来，聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)技术已成为诊断侵袭性真菌体最常用的一种方法，而多重实时荧光PCR技术(Real-TimePCR，RT-PCR)成为被广泛应用的侵袭性真菌的分型技术。目前，国内外均建立了采用基于PCR技术对侵袭性真菌进行快速检测的方法。例如，中国专利申请号为201410820825.8的专利技术专利申请公开了使用TAQMAN探针法检测15项侵袭性真菌的方法：8种假丝酵母菌(白色念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母、乳酒假丝酵母、清酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、季也蒙假丝酵母、热带假丝酵母)，4种曲霉菌(黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、烟曲霉)以及隐球菌、米根霉和卷枝毛霉，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对于侵袭性真菌感染的早期诊断和治疗具有重大意义。再如，中国专利申请号为201510586315.3的专利技术专利申请公开了使用RT-PCR检测烟曲霉的方法：建立了一种针对烟曲霉进行特异性检测的荧光定量PCR方法(探针法)，该PCR检测体系的检测敏感性方面，线性检测范围的下限可至102copies/mL，上限可达108copies/mL，敏感性、特异性和稳定性均较好。需要注意的是，上述两个专利技术专利申请中核酸的提取是通过人工操作实现的，且对于结果的判断是通过说明书进行人工判断的，存在一定的主观性。常用的PCR检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。其中曲霉属的检测方案均与青霉菌有99％的序列相似性，因此利用荧光PCR技术无法区分青霉菌，存在假阳性的风险。此外，RT-PCR所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。
技术实现思路
本公开的目的是提供一种快速、准确的检测侵袭性真菌的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQIDNO.1-10所示的引物和SEQIDNO.15-23所示的探针。可选地，相对于1μM的SEQIDNO.1所示的引物，分别由SEQIDNO.2-10所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.9-1.1μM、0.3-0.5μM、0.9-1.1μM、0.2-0.4μM、0.9-1.1μM、0.1-0.3μM、0.9-1.1μM和0.1-0.3μM，分别由SEQIDNO.15-23所示的探针的含量各自为0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM和0.1-0.3μM。可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控和阴性内质控；所述阳性内质控含有SEQIDNO.11-12所示的引物和SEQIDNO.24所示的探针；所述阴性内质控含有SEQIDNO.13-14所示的引物和SEQIDNO.25所示的探针。可选地，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQIDNO.1-2所示的引物和SEQIDNO.15-18所示的探针；B管含有SEQIDNO.3-8所示的引物和SEQIDNO.19-21所示的探针；C管含有SEQIDNO.9-10所示的引物和SEQIDNO.22-23所示的探针；D管含有SEQIDNO.11-14所示的引物和SEQIDNO.24-25所示的探针。可选地，SEQIDNO.15,19,22,24所示的探针具有第一荧光标记；SEQIDNO.16,20,23所示的探针具有第二荧光标记；SEQIDNO.17,21所示的探针具有第三荧光标记；SEQIDNO.18,25所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。可选地，所述侵袭性真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、曲霉菌属、毛霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑10所示的引物和SEQ ID NO.15‑23所示的探针。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测侵袭性真菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQIDNO.1-10所示的引物和SEQIDNO.15-23所示的探针。2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μM的SEQIDNO.1所示的引物，分别由SEQIDNO.2-10所示的引物的含量各自为0.3-0.5μM、0.9-1.1μM、0.3-0.5μM、0.9-1.1μM、0.2-0.4μM、0.9-1.1μM、0.1-0.3μM、0.9-1.1μM和0.1-0.3μM，分别由SEQIDNO.15-23所示的探针的含量各自为0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.2-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM、0.1-0.3μM和0.1-0.3μM。3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阳性内质控和阴性内质控；所述阳性内质控含有SEQIDNO.11-12所示的引物和SEQIDNO.24所示的探针；所述阴性内质控含有SEQIDNO.13-14所示的引物和SEQIDNO.25所示的探针。4.根据权利要求3所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括A管、B管、C管和D管；A管含有SEQIDNO.1-2所示的引物和SEQIDNO.15-18所示的探针；B管含有SEQIDNO.3-8所示的引物和SEQIDNO.19-21所示的探针；C管含有SEQIDNO.9-10所示的引物和SEQIDNO.22-23所示的探针；D管含有SEQIDNO.11-14所示的引物和SEQIDNO.24-25所示的探针。5.根据权利要求4所述的核酸试剂，其中，SEQIDNO.15,19,22,24所示的探针具有第一荧光标记；SEQIDNO.16,20,23所示的探针具有第二荧光标记；SEQIDNO.17,21所示的探针具有第三荧光标记；SEQIDNO.18,25所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、CY5荧光标记、ROX荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。6.根据权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，其中，所述侵袭性真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、曲霉菌属、毛霉菌、新型隐球菌、耶氏肺孢子虫和卡氏肺孢子虫中的至少一种。7.一种用于检测侵袭性真菌的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～6中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。8.权利要求1～6中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测侵袭性真菌的试剂盒中的用途。9.一种用于检测侵袭性真菌的系统，该系统包括具有A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器的PCR仪、计算装置和输出装置，所述A管检测器、B管检测器、C管检测器和D管检测器分别为装载有权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道，所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地为FAM荧光通道、JOE荧光通道、CY5荧光通道、ROX荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道或Quasar670荧光通道；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：若A管第一荧光通道有Tm值为65℃对应的溶解峰曲线、D管第一荧光通道有Tm为57℃对应的溶解峰曲线、D管第四荧光通道有Tm值为60℃的溶解峰曲线，则判定为白色念珠菌阳性；若A管第二荧光通道有Tm值为60℃对应的溶解峰曲线、D管第一荧光通道有Tm为57℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：林笑冬，王雷，王晓艳，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11