一种鉴别四种镰刀菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴别四种镰刀菌的方法，属于高分辨熔解曲线分析技术领域。本发明专利技术方法采用1对特异性引物，基于实时荧光PCR(RT‑PCR)熔解曲线鉴别层生镰刀菌，尖孢镰刀菌，半裸镰刀菌，腐皮镰刀菌，所述1对特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明专利技术灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于临床诊断、农业生产、食品安全等方面镰刀菌种的鉴别，从而为镰刀菌的感染治疗、农业生产和食品安全的监测提供确实可靠的依据。

A Method for Identifying Four Fusarium Species

The invention provides a method for identifying four Fusarium species, belonging to the field of high resolution melting curve analysis technology. The method adopts a pair of specific primers to identify Fusarium laminatum, Fusarium oxysporum, Fusarium seminaked and Fusarium putrefaciens based on the melting curve of real-time fluorescent PCR (RT PCR). The sequence of the pair of specific primers is shown as SEQ ID NO.1 2. The invention has high sensitivity, good specificity and fast detection speed, and can be used for the identification of Fusarium species in clinical diagnosis, agricultural production, food safety and other aspects, thus providing reliable basis for the treatment of Fusarium infection, agricultural production and food safety monitoring.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别四种镰刀菌的方法
本专利技术涉及多种真菌检测
，具体地说涉及一种鉴别四种镰刀菌的方法，所述四种镰刀菌为层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)。
技术介绍
镰刀菌属于有丝分裂孢子真菌，广泛存在于土壤中和植物上，属于条件致病菌。镰刀菌属中有许多危害经济植物的种，它们是植物维管束系统的寄生菌，在适宜的环境条件下，不但破坏作物的输导组织维管束，而且在菌体生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫、穗腐、腐烂、死亡，影响产量和品质，严重时可导致产量显著下降。致病性尖孢镰刀菌侵染植物引起植物枯萎病，导致维管束病害，造成植株枯死，其在植株的全生育期均可发生，对生产造成巨大损失。腐皮镰刀菌可引起多种经济作物根腐病，还可引起一些植物的果实腐烂，如甜辣椒果腐病。半裸镰刀菌侵染双孢蘑菇子实体后，一般表现为生长发育受阻、生长无力，子实体颜色淡黄，严重者变成长大的僵菇或萎缩菇。镰刀菌产生的毒素种类繁多，其中主要是玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素、串珠镰刀菌素和伏马菌素等，对人体和家畜都具有巨大危害。层生镰刀菌可引起角膜炎、眼内炎、甲真菌病(甲癣)、浅表性化脓性血栓性静脉炎，免疫力低下患者可致严重的系统感染甚至危及生命。研究显示，我国中原地区真菌性角膜炎感染镰刀菌以腐皮镰刀菌复合体最多，尖孢镰刀菌复合体居第三位。人进食被镰刀菌侵染的麦子或玉米后半小时至一小时可出现中毒症状，即醉谷病。拟枝孢镰刀菌等侵染谷物后，产生的毒素可侵害人造血系统和其他器官，致使白血细胞和血小板大量减少，导致中毒性白细胞缺乏症；其侵染牛毛草也可使牛食后出现失重、驼背、烂蹄、牛尾坏死等症状。镰刀菌毒素难以分解、毒素活性检测困难、有效的脱毒过程较为复杂，故对食品和农作物真菌污染的早期鉴定显得尤为重要。真菌核糖体基因转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段。rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近。ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。传统的镰刀菌分类鉴定方法主要依靠其形态特征，比较费时，常常需要2～3周才能得到最终结果。有时培养物不典型或不产孢，使得鉴定困难。除形态学培养鉴定外，常用通用引物ITS1、ITS4对rDNAITS基因PCR扩增后测序，将测序结果在NCBI进行基本局部比对，根据比对结果判断菌种，但有时该方法难以对所有真菌菌株进行准确鉴定，存在无法扩增的现象。此外，还常用PCR-RFLP鉴定镰刀菌种，即比较不同镰刀菌rDNAITS序列的限制型内切酶位点，设计特异性引物进行PCR扩增，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可用PAGE分离，从而区分不同菌种。上述方法虽然普遍应用，但耗时较长，可能延误治疗，使患者病情加重，或者无法及时鉴定病原影响食品安全监测的时效性。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种基于RT-PCR熔解曲线分析的鉴别四种镰刀菌的方法，特别是一种利用高分辨熔解曲线分析及时鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种能同时鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的一对特异性引物。本专利技术应用遗传分析方法——高分辨熔解曲线(Highresolutionmelting,HRM)分析技术。通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，ITS序列不同会使双链DNA的Tm值发生变化，从而双链DNA在升温过程中先后解链，形成不同的熔解曲线形状。荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上就能判断是否存在有差异的ITS片段，且ITS序列的差异会影响熔解曲线的峰形，能有效区分不同菌种的ITS序列。为了实现本专利技术的目的，本专利技术仔细研究了层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)这四种镰刀菌的基因组序列，在ITS序列中寻找差异性靶序列，通过精心设计和筛选，设计一对特异性引物，使用该对引物通过HRM技术能够特异地鉴别上述四种镰刀菌。本专利技术首先提供了能鉴别上述四种镰刀菌的特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。本专利技术提供了含有上述特异性引物的试剂盒或检测试剂。本专利技术提供了所述特异性引物在鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)中的应用。本专利技术提供了上述的特异性引物在保障食品安全中的应用。本专利技术提供一种鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的方法，是应用上述的特异性引物，以待测样品的DNA为模板，使用RT-PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中熔解曲线的峰形判定结果。上述RT-PCR方法中30μLPCR反应体系为：2×MixTaqmanPCRMaster15μL、上下游引物各0.9μL、RoxReferenceDyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×inWater1.5μL、待测DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。RT-PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，58℃25s，72℃25s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。本专利技术上述方法的熔解曲线制作条件为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续检测荧光强度；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。具体地，本专利技术方法鉴别结果的判断原则是每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的镰刀菌，其中，Tm值在87～89℃范围内出现熔解峰为层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)检出；Tm值在84本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鉴别四种镰刀菌的特异性引物，所述四种镰刀菌为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)，半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)，腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示的引物。

【技术特征摘要】
1.鉴别四种镰刀菌的特异性引物，所述四种镰刀菌为层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示的引物。2.含有权利要求1所述特异性引物的试剂盒或检测试剂。3.权利要求1所述特异性引物在鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)中的应用。4.权利要求1所述的特异性引物在保障食品安全中的应用。5.一种鉴别层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl.)，半裸镰刀菌(Fusariumsemitectum)，腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的特异性引物，以待测样品的DNA为模板，使用RT-PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中熔解曲线的峰形判定结果。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，RT-PCR方法中30μLPCR反应体系为：2×MixTaqmanPCRMast...

【专利技术属性】
技术研发人员：周梦诗，李睿，蔡虎，
申请(专利权)人：西安博睿康宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61