一种制备临床级脂肪干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备临床级脂肪干细胞的方法。具体地，本发明专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法包括步骤：1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a‑MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。

A Method for Preparing Clinical Grade Adipose Stem Cells

The invention relates to a method for preparing clinical adipose stem cells. Specifically, the method for preparing clinical-grade adipose stem cells according to the present invention comprises the following steps: 1) washing adipose tissue with salt water containing penicillin-streptomycin mixture, cutting and removing fat; 2) chymidizing adipose tissue obtained in step 1; 3) adding chymidized adipose tissue obtained in step 2 to a MEM medium containing enzyme mixture for digestion, in which the enzyme is involved. The mixture consisted of type I collagenase, hyaluronidase, deoxyribonuclease I and trypsin, and 4) digestive solution of centrifugation step 3, discarding supernatant, adipose stem cells were obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种制备临床级脂肪干细胞的方法
本专利技术涉及细胞培养技术和生物治疗领域，特别涉及一种临床级脂肪干细胞制备方法。
技术介绍
脂肪干细胞(adiposederivedstemcells,ADSC)是指从脂肪组织中分离出的具有自我更新及多向分化潜能的成体间充质干细胞。具有干细胞的一些共同特点，在体外适宜的诱导条件下具有自我更新、高增殖能力及具有向成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等分化潜能而受到广泛关注。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。ADSC是符合再生医学要求的干细胞，比其他干细胞更适合组织工程，可作为组织工程的种子细胞。各种组织特别是缺乏再生能力的组织，如软骨、肌肉、心肌、神经等的损伤修复一直是医学领域里的难题。已有大量的动物研究实验证实，ADSC对多种疾病具有治疗效果，例如骨骼和肌肉系统疾病、泌尿系统疾病、心血管系统疾病、慢性损伤、自身免疫性疾病等。截至2013年3月，在美国国立卫生院官方网站上已注册的ADSC临床试验项目有68项，包括骨缺损、脑卒中、克罗恩病、移植物抗宿主病、软组织缺损等疾病的治疗。目前脂肪干细胞的分离方法多采用酶消化进行分离，但获取细胞数量不足，且活力较低，长期传代中常常发生老化，培养基中添加外源血清及因子等完全不符合临床应用要求，这些因素都大大增加了临床使用时风险。有鉴于此，本专利技术提供了一种临床级脂肪干细胞的分离和制备方法。该方法得到的脂肪干细胞数量多、活力强、且所消耗的时间短。体外扩增后进行其表面标志、分化能力、活率等均符合临床回输要求。
技术实现思路
本专利技术涉及一种制备临床级脂肪干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a-MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述方法进一步包括在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞。优选地，根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞1至10代；进一步优选地，在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞5代。根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含HeliosUltraGRO细胞营养添加物。根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基进一步包含EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的因子组合。优选地，根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含的EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的浓度分别为10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml和10～20ng/ml；进一步优选地，根据本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述EGF、bFGF、TGF、HGF和PDGF的浓度分别为20ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml和10ng/ml。优选地，根据权利要求本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤2)中通过将剪碎的脂肪组织加入注射器中，并反复推注注射器使脂肪组织乳糜化，其中，优选地反复推注注射器1分钟至5分钟，每分钟10-30次；更优选地，反复推注注射器3分钟，每分钟30次。优选地，根据权利要求本专利技术所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在步骤3)酶混合物中包含0.1mg/ml的I型胶原酶、0.05mg/ml的脱氧核糖核酸酶I、0.1mg/ml的透明质酸酶和0.125％的胰蛋白酶。附图说明图1A至图1C是本专利技术实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代细胞的倒置显微镜图。其中，图1A表示4X；图1B表示10X；图1C表示20X。图2A至图2B-1、图2B-2和图2B-3是本专利技术实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代细胞经细胞计数仪活率检测的报告。图2A显示该报告的图片信息；图2B-1、图2B-2和图2B-3分别表示直径分布图、FL1荧光强度分布图和FL2荧光强度分布图。图3A至图3C是本专利技术实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代细胞分化能力的检测图片；其中，图3A表示成脂，油红染色；图3B表示成骨，茜素红S染色；图3C表示成软骨，阿辛蓝染色。图4是本专利技术实施例制备的脂肪干细胞体外培养的P5代的细胞流式表型鉴定结果。图5显示脂肪干细胞培养方法的比对实验。其显示分别在a-MEM+10％FBS、a-MEM+细胞营养添加物或a-MEM+细胞营养添加物+组合因子培养基中连续培养至P5代的细胞生长数量。具体实施方式结合以下具体实施方式和实施例进一步说明本专利技术，但是，在不偏离本专利技术主旨的情况下，本领域技术人员可以结合现有技术的公知常识对该具体实施方式进行改变，其均在本专利技术的范围内。本专利技术提供了一种临床级脂肪干细胞的制备方法，步骤如下：(1)双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎，去除杂质、油脂等物质；(2)通过注射器反复推注乳糜化脂肪组织，缩短消化时间，提高干细胞数量及活力；(3)采用用I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I、胰蛋白酶的混合酶对脂肪组织进行消化，过滤、洗涤，弃上清得到脂肪干细胞。进一步地，本专利技术的方法还包括以下步骤：(4)将脂肪干细胞接种于a-MEM培养基中进行培养，培养基中含有细胞营养添加物、EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF，不含外源血清等不符合临床级培养试剂。作为一种优选的方案，步骤(1)中脂肪来源于美容吸脂液和手术脂肪块均可，吸脂液更加方便，6小时内进行脂肪干细胞提取；更为优选的是，步骤(2)通过注射器反复推注乳糜化脂肪组织，30次/min,推注3min；更为优选的是，步骤(3)混合消化酶为0.1mg/ml的I型胶原酶、0.05mg/ml的脱氧核糖核酸酶I、0.1mg/ml的透明质酸酶、0.125％的胰蛋白酶；更为优选的是，步骤(4)培养基中加入细胞营养添加物，使用浓度为5％，不含外源血清等不符合临床级培养试剂作为优选的是，步骤(4)中EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF的浓度分别为10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml、10～20ng/ml和10～20ng/ml；更为优选的，EGF、bFGF、TGF、HGF、PDGF的浓度分别为20ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、10ng/ml和10ng/ml。实施例1：脂肪干细胞的分离和制备通过以下步骤分离和制备脂肪干细胞：1)从美容吸脂液或手术的脂肪块获得脂肪组织，用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，其中，青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml，剪碎，去除油脂等杂质；2)从步骤1)中获得的脂肪组织中取出30ml加入到50ml注射器中，通过反复推本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备临床级脂肪干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a‑MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备临床级脂肪干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：1)用含有青链霉素混合液的双抗盐水洗涤脂肪组织，剪碎并去除油脂；2)使步骤1)中获得的脂肪组织乳糜化；3)将步骤2)中获得的乳糜化的脂肪组织加入到含有酶混合物的a-MEM培养基中消化，其中所述酶混合物包含I型胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶I和胰蛋白酶；和4)离心步骤3)的消化液，弃上清，得到脂肪干细胞。2.根据权利要求1所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述方法进一步包括在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞。3.根据权利要求2所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞1至10代。4.根据权利要求3所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中在不含血清的a-MEM培养基中培养步骤4)所获得的脂肪干细胞5代。5.根据权利要求4所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基包含HeliosUltraGRO细胞营养添加物。6.根据权利要求5所述的制备临床级脂肪干细胞的方法，其中所述不含血清的a-MEM培养基进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜丽君，李超，
申请(专利权)人：吉林省拓华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22