环孢菌素H环糊精及其用途制造技术

本申请涉及环孢菌素H与环糊精的包合物，其制备方法，及其用于治疗脑出血后脑水肿的方法和制药用途。

Cyclosporin H Cyclodextrin and Its Application

The present application relates to the inclusion complex of cyclosporin H and cyclodextrin, the preparation method thereof, the method for treating brain edema after cerebral hemorrhage and the pharmaceutical use thereof.

【技术实现步骤摘要】
环孢菌素H环糊精及其用途
本申请涉及环孢菌素H的环糊精包合物，及其用于治疗脑出血后脑水肿的方法和制药用途。
技术介绍
环孢菌素H(CsH)环孢菌素H(CyclosporinH)是由11个氨基酸组成的环状十一肽:环[L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-3-羟基-N,4-二甲基-L-2-氨基-6-辛烯酰-L-2-氨基丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰]，分子式为C62H111N11O12，结构如下：CsH是甲酰肽受体1(FormylPeptideReceptor1，简称FPR1)的天然拮抗剂。FPR1主要表达于哺乳动物的某些免疫细胞(如组织内的吞噬细胞和血液白细胞等)，其功能是介导细胞对入侵微生物和自身组织损伤释放的N-甲酰甲硫氨酸寡肽的应答。在Wenzel等人利用30nM甲酰肽FMLP(即N-甲酰基甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)激活人嗜中性粒细胞的实验中，原本FMLP的激活作用诱导了超氧化物(O2-)的形成，但CsH的加入却可抑制FMLP与FPR1受体结合并由此诱导的O2-形成，当CsH为40nM时达到半数最大效应，当CsH为1μM时O2-形成现象消失了(Wenzel等人，JImmunol.1991，147(6):1940-6)。目前，CsH主要用于科学研究，尚未用于临床治疗疾病，这可能是由于CsH不溶于水，也不易穿越血脑屏障被递送到中枢神经系统。鉴于CsH在肿瘤、抗病毒感染和炎症相关疾病中潜在的临床应用价值，对其分子结构或理化属性进行改造有望形成符合临床需求的新药物。环糊精及其包合作用环糊精能广泛与多种两亲性和亲脂性分子形成稳定的非共价包合物(Challa等,AAPSPharmSciTech.2005；6(2):E329–E357)。它们具有亲脂性内腔和亲水外表面，这使得它们有良好的水溶性。已知环糊精有α-,β-,和γ-三种天然形式。脑出血后脑水肿脑出血在全球范围内仍然是致死致残率最高的脑卒中类型，每年中国新增脑出血患者约60万人。1年死亡率可达50％，5年死亡率高达70％，且仅有20％的存活患者能在6个月后独立生活。脑出血后脑内形成血肿周围脑水肿(PHE)进一步加重患者的脑损伤和神经功能缺陷(Murthyetal，Stroke.2015Nov；46(11):3088-92.)。目前，尚无特异性药物靶向治疗血肿周围脑水肿。大分子药物穿越血脑屏障始终是世界性难题。由脑毛细血管独有的紧密连接蛋白形成的血脑屏障(BBB)阻止了大脑对大部分药物和生物大分子的吸收，造成仅分子量小于400Da的小分子药物能够自由扩散到脑组织(WilliamMPardridge.JCerebBloodFlowMetab.2012Nov；32(11):1959–1972.)。分子量超过1000的环孢菌素H显然不能自由通过BBB在脑组织内发挥作用。
技术实现思路
本申请人首次发现，拮抗FPR1可以改善脑出血后脑水肿，即，FPR1可作为治疗脑出血后血肿周围脑水肿的治疗靶点。本申请人采用环糊精包合CsH，使不溶于水的CsH在水溶液内的浓度达到Wenzel1991(出处同上)所述半抑制浓度的20万倍。本申请人还意外发现此包合物能促使CsH穿透血脑屏障，在脑组织内达到或超过Wenzel所述半抑制浓度。由于水溶性大大提高，本申请所制得的CSH环糊精包合物适于口服、皮下注射、静脉注射等多样化的给药方式，尤其对于脑出血昏迷、无法进食的病人给药具有重大意义。CsH的环糊精包合物(inclusioncomplex)环糊精对目标分子的包合形式是灵活的。如果一个目标分子能进入环糊精中空环内，理论上只需一个环糊精分子即可完成包合；一个目标分子太大，进不到单个环糊精的中空环内，需要至少n个环糊精包绕目标物，此时的摩尔比从1:1相应增大到1：n以上。因此，目标分子在环糊精水溶液中的溶解度与环糊精的浓度正相关。本申请人将CsH与不同浓度的环糊精混合，结果发现，将CsH与环糊精以大约1：30.5的摩尔比混合，就足以使CsH完全溶,表现为CsH环糊精包合物水溶液澄清，而CsH水溶液呈悬浊液。继续增加环糊精的量，CsH的溶解度也相应增加。当CsH与环糊精以1：50的摩尔比混合时，CsH在水中的溶解度可高达8000μM，这相当于Wenzel1991(出处同上)中半抑制浓度40nM的20万倍。考虑到三次独立制备包含物得到的CsH回收率最低为78％，本申请的包合物中CsH与环糊精摩尔比不少于1:23，优选为1：23～1：39，更优选1：30～1：33。因本申请的包合物所能提供的CsH浓度远超抑制FPR1所需的浓度，故该包合物适合制作各种剂型的CsH药物，例如注射剂，粉剂，胶囊剂，等。CsH不易穿越血脑屏障(BBB)。有报道称，给与患者环孢菌素类物质，其在人脑脊液中含量不足血液含量千分之一。本申请的动物实验显示，CsH给与小鼠后，在小鼠脑组织中的含量不足血液含量的0.05％(图2D)，与之前报道的病人情况接近。可见，单纯的CsH用药难以抵达脑中枢组织内发挥作用，需要对CsH进行改造。本申请的CsH环糊精包合物经小鼠尾静脉注射，在注射后4小时小鼠脑组织内的CsH达到了抑制FPR1受体所需半抑制浓度的1.22倍(图2E)，而对照组的CsH仅是该半抑制浓度的0.0375倍，几乎无抑制FPR1活性。因此，该包合物有利于CsH在脑中枢疾病中应用。由于拮抗剂抑制受体的效率和拮抗剂浓度之间呈S状曲线。在半抑制浓度附近，拮抗剂的抑制效率与拮抗剂的浓度接近线性变化。当拮抗剂浓度过高/过低时，拮抗剂的抑制效率改变不明显。本申请的环糊精除了包括上述任一种天然形式，还包括改性的环糊精，如修饰了烷基、羟烷基、二烷基和硫烷基醚的环糊精，等等。例如，对羟丙基和硫烷基醚进行化学修饰可增加天然环糊精的水溶性和复合能力(Thompson1997,Mulleretal.,1985,Szenteetal.,1999)。在本申请的一个具体实施方案中，环糊精是(2-羟丙基)-β-环糊精(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin,简称“HP-β-CD”)。本申请的环糊精还包括环糊精醚，环糊精酯，桥联环糊精，环糊精交联聚合物，以及与高分子相连环糊精，等等。治疗脑出血后脑水肿目前，临床上尚无药物靶向干预FPR1来治疗脑水肿。本申请人发现，脑出血后血肿周围组织和外周免疫细胞的FPR1信号是干预脑水肿治疗新的潜在途径。本申请对脑出血病人血肿周围组织的全基因组表达谱测序，结果提示：在脑出血后6小时、24小时情况下，血肿周围脑组织接收坏死细胞释放的线粒体甲酰肽的FPR1受体在所有20余种危险信号受体中上调最显著，表达量最高(图3)。本申请在脑出血小鼠模型上抑制FPR1，脑水肿显著减轻；脑内小胶质细胞的活性和浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等显著减少，小鼠的死亡率显著下降(图4和图5)。可见，FPR1信号在脑出血后脑内炎症、血管通透性和脑水肿形成中起到了关键作用。脑出血后血肿周围组织和外周免疫细胞的FPR1信号可作为干预脑水肿治疗新的潜在途径。CsH作为FPR1的天然特异性抑制剂，如果能克服不溶于水和不能突破BBB的缺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环孢菌素H的环糊精包合物，其中环孢菌素H与环糊精的摩尔比不小于1:23。

【技术特征摘要】
1.环孢菌素H的环糊精包合物，其中环孢菌素H与环糊精的摩尔比不小于1:23。2.权利要求1的包合物，其中环孢菌素H与环糊精的摩尔比介于1:30～1:33之间。3.权利要求1的包合物，其中的环糊精选自β-环糊精，羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚-β-环糊精。4.权利要求1的包合物，其为液体剂型。5.权利要求1的包合物的制备方法，是环按孢菌素H比环糊精的摩尔比...

【专利技术属性】
技术研发人员：施福东，李治国，么阳，
申请(专利权)人：天津医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：天津,12