基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。本发明专利技术制备的嵌合抗原受体能够靶向间皮素，提高CAR‑T细胞治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用。
技术介绍
间皮素(mesothelin)在多种肿瘤中高表达，是一种较好的肿瘤治疗靶点。利用转基因技术，将识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR)序列转导入T细胞中，能够产生特异识别间皮素、杀伤肿瘤细胞的CAR-T细胞。CAR-T细胞治疗在血液系统肿瘤中展示了良好效果，但在实体肿瘤中的效果却难以令人满意。CAR-T细胞在实体瘤治疗中出现的短板与以下3个问题有关：1、CAR-T细胞识别区的来源是人源或是其他物种；2、CAR中的连接片段是否能够高效将胞外识别区信号传递给胞内活化区以启动T细胞杀伤；3、CAR活化后是否会导致T细胞迅速无能乃至耗竭。
技术实现思路
本专利技术主要提供了一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体能够靶向间皮素，提高CAR-T细胞治疗效果。其技术方案如下：一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。优选的，所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述人源间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述人CD8a分子柔性片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述人CD28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述人CD3z分子胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。一种核酸序列，所述核酸序列用于编码上述嵌合抗原受体，所述核酸序列如SEQIDNO.8所示。一种慢病毒表达载体，所述载体载有上述嵌合抗原受体。优选的，所述嵌合抗原受体为在pCDH-EF1-MSC质粒中表达，形成pCDH-EF1-CAR-meso28BBz制粒。一种慢病毒，所述慢病毒为将上述慢病毒表达载体与包装制粒psPAX2和pMD2.G共转染靶细胞得到。上述嵌合抗原受体在制备靶向间皮素的CAR-T细胞中具有医学上的应用。采用上述方案，本专利技术具有以下优点：(1)CAR主要由3部分构成：胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中，胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性，往往由scFv序列构成，但很多scFv序列是小鼠来源的，会造成较强的免疫排斥反应，导致CAR-T细胞治疗无效。而我们选择了高亲和性识别间皮素的人源scFv序列(anti-mesoscFv)，既能够有效避免免疫排斥，又能够高效识别靶细胞。胞内信号区也是决定CAR-T细胞治疗效果的重要结构，我们通过加入CD28和41BB双信号分子，显著提高了CAR-T细胞的功能与扩增。信号转导区的结构选择也影响CAR-T细胞功能。我们利用CD8铰链区保证胞外识别区与信号区之间有了很好的结合，保证了CAR-T细胞的功能。此外，我们还添加了CD28与41BB双刺激分子结构，既保证了T细胞杀伤能力，还能维持T细胞增殖。(2)采用非人源scFv作为识别区时，CAR-T细胞往往受到机体排斥，导致治疗失败。本专利技术采用了完全人源的抗间皮素scFv作为CAR-T细胞识别区，可以有效避免上述问题，有助于治疗效果改善。另外，我们采取了CD28与41BB双刺激信号，既能够提高T细胞杀伤活性，也能够改善T细胞增殖与生存。此类转基因修饰的CAR-T细胞具备更强、更持久的杀伤能力，有望提高实体瘤治疗效果。附图说明图1为meso-CAR结构示意图；图2为流式细胞术检测T细胞表达CAR表达情况图；图3为CAR-T细胞增殖情况图；图4为CAR-T细胞特异杀伤间皮素阳性细胞结果图；图5为CAR-T细胞控制小鼠肿瘤生长情况图。具体实施方式以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。一、CAR结构meso-CAR基本结构由人CD8a分子信号肽(Leadingsignal)、人源间皮素单链抗体(scFv)、人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)、人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)、人41BB分子胞内区(41BB)和人CD3z分子胞内区(CD3z)依次串联构成，串联形成的结构如图1所示。所述meso-CAR结构的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。其中，人CD8a分子信号肽(Leadingsignal)的氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQIDNO.1)人源间皮素单链抗体(HumanscFv)的氨基酸序列为：QVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIK(SEQIDNO.2)人CD8a分子柔性片段(CD8Hinge)的氨基酸序列为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQIDNO.3)人CD28分子跨膜区与胞内区(CD28)的氨基酸序列为：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQIDNO.4)人41BB分子胞内区(41BB)的氨基酸序列为：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQIDNO.5)人CD3z分子胞内区(CD3z)的氨基酸序列为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQIDNO.6)二、CAR序列合成及载体构建CAR编码序列由上海生工公司合成，获得的meso-CAR结构的DNA序列(SEQIDNO.8所示)通过酶切连接插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，构建慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-meso28BBz。三、慢病毒包装包装细胞293T铺板24小时后，将pCDH-EF1-CAR-meso28BBz表达质粒与包装质粒(psPAX2与pMD2.G)混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染。转染48小时后，收集上清，准备用于T细胞感染。四、T细胞纯化与感染人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天。2天后，加入病毒上清与polybrene(6μg/mL)孵育过夜。次日本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体由人CD8a分子信号肽、人源间皮素单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区、人41BB分子胞内区、人CD3z分子胞内区依次串联构成。2.根据权利要求1所述的基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人CD8a分子信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述人源间皮素单链抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述人CD8a分子柔性片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述人CD28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述人41BB分子胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，所述人...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，李峰，张震，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41