一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX‑god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得。本发明专利技术所述的枯草芽孢杆菌工程菌表达体系具有安全、无内毒素的特点，在食品和医药产业化领域备受认可。

【技术实现步骤摘要】
一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用
本专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用，属于基因工程和发酵工程

技术介绍
葡萄糖氧化酶(GOD)是一种氧化还原酶，在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。目前GOD的应用领域不断拓展，国内外市场需求量急剧增加。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素。芽孢表面展示是一项能在芽孢表面表达并展示具有生物活性的外源蛋白的技术，它将外源蛋白的基因与芽孢衣壳蛋白基因融合，从而将外源蛋白锚定在芽孢表面。(Isticatoetal.2001))第一次实现外源蛋白与枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白的融合表达，从此芽孢表面展示技术受到广泛的关注，枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术应用最普遍的原因是因为具有以下几种优势：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于GRAS分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。中国专利文献CN105132450A(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot表面展示海藻糖合酶的方法。本专利技术利用Cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出Cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。将GOD展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面，然后投入以葡萄糖为底物的转化体系中生产葡萄糖酸衍生物，使反应达到循环往复，提高了酶的热稳定性和操作稳定性，又降低了生产成本，同时其可控、简单的工艺便于连续生产为工业化大规模应用提供可能。但上述衣壳蛋白在展示GOD时酶活过低，没有工业化应用价值是制约该技术应用的主要瓶颈。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的方法与应用。本专利技术利用五种不同的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白同时作为分子载体，在整合型质粒pDG1730的基础上构建一个可以在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的载体，通过电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以在芽孢表面展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌。本专利技术技术方案如下：一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX-god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；所述cotB-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述cotC-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述cotE-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述cotG-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述cotX-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。根据本专利技术优选的，所述载体为整合型载体pDG1730。根据本专利技术优选的，所述重组载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。上述在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的方法，步骤如下：(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列；所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：cotC-F：aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGABamHI；cotC-R：GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC；所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：cotG-F：ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG；cotG-R：ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG；所述CotX蛋白基因的扩增引物如下所示：cotX-F：gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA；cotX-R：GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG；所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：cotE-F：gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAANheI；cotE-R：GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC；所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：cotB-F：gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG；cotB-R：GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG；以黑曲霉Aspergillusniger为模板扩增分别与芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白重叠的葡萄糖氧化酶的基因序列；所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotc-god-F：AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT；cotc-god-R：aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotG-god-F：CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT；cotG-god-R：ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotX蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotX-god-F：GTTATCACTCTTGTCCTCATGAAGTTCCCAATCCTT；cotX-god-R：tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAACNheI、NotI；所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotE-god-F：GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT；cotE-god-R：cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotB蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotB-god-F：TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT；cotB-god-R：gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAACNotI、HindIII；(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的孢衣壳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG‑god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX‑god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；所述cotB‑god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述cotC‑god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述cotE‑god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述cotG‑god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述cotX‑god基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过向载体中插入芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotB-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotC-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotE-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotG-god基因片段、芽孢衣壳蛋白基因与葡萄糖氧化酶基因的cotX-god基因片段，构建重组载体，然后转化枯草芽孢杆菌制得；所述cotB-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述cotC-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述cotE-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述cotG-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述cotX-god基因片段核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述载体为整合型载体pDG1730。3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述重组载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。4.权利要求1所述在芽孢表面高效展示葡萄糖氧化酶的枯草芽孢杆菌工程菌的方法，其特征在于，步骤如下：(1)以枯草芽孢杆菌WB800n基因组为模板，PCR扩增芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列；所述CotC蛋白基因的扩增引物如下所示：cotC-F：aaaactggtctgatcggatccGCAAAGAAGACAAACAAATGTAGGABamHI；cotC-R：GGGAACTTCATGTAGTGTTTTTTATGCTTTTTATACTC；所述CotG蛋白基因的扩增引物如下所示：cotG-F：ggatgctggtaatgcttagTTTTTAAAACCGCGCGTACTATG；cotG-R：ACTTCATTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG；所述CotX蛋白基因的扩增引物如下所示：cotX-F：gatgctggtaatgcttagCCAATCATAAAAAATAGGGTTCTTCA；cotX-R：GATTGGGAACTTCATGAGGACAAGAGTGATAACTAGG；所述CotE蛋白基因的扩增引物如下所示：cotE-F：gctggtaatgcttaggctagcGAACTAAATAATCTATGTACCAAATGTTCAANheI；cotE-R：GGAACTTCATTTCTTCAGGATCTCCCACTAAAAACTC；所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：cotB-F：gctggtaatgcttagATGCGTGAAAATGGGTATTCG；cotB-R：GAACTTCATAAATTTACGTTTCCAGTGATAG；以黑曲霉Aspergillusniger为模板扩增分别与芽孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白重叠的葡萄糖氧化酶的基因序列；所述与CotC蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotc-god-F：AAAGCATAAAAAACACTACATGAAGTTCCCAATCCTT；cotc-god-R：aCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotG蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotG-god-F：CAAAAAGAAATACAAAATGAAGTTCCCAATCCTT；cotG-god-R：ggCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotX蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotX-god-F：GTTATCACTCTTGTCCTCATGAAGTTCCCAATCCTT；cotX-god-R：tgcaggaattcgataagcttGCGGCCGCTTTAGGCTAGCCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAACNheI、NotI；所述与CotE蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotE-god-F：GGAGATCCTGAAGAAATGAAGTTCCCAATCCTT；cotE-god-R：cgcatCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAAC；所述与CotB蛋白基因PCR重叠扩增的葡萄糖氧化酶god基因序列的扩增引物如下所示：cotB-god-F：TATCACTGGAAACGTAAATTTATGAAGTTCCCAATCCTT；cotB-god-R：gaattcgataagcttgcggccgcCTAAGCATTACCAGCATCCTTAATAACNotI、HindIII；(2)分别采用重叠PCR将步骤(1)制得的孢衣壳蛋白中CotB，CotC，CotE，CotG和CotX蛋白的基因序列与其对应的葡萄糖氧化酶基因片段god分别融合，制得cotC-god(Cg)、cotG-god(Gg)、cotX-god(Xg)、cotE...

【专利技术属性】
技术研发人员：王腾飞，林平，刘洪玲，马耀宏，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37