一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，本发明专利技术还公开了该敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，实验结果表明发酵产敲除大肠杆菌中fimA基因，对大肠杆菌发酵产L‑苏氨酸有一定的促进作用，在增加L‑苏氨酸的产量的同时可以缩短发酵周期。

【技术实现步骤摘要】
一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
L-苏氨酸是由W.C.Rose在1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的一种氨基酸，它是人体和动物所需的八种氨基酸中仅次于蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的第四种必需氨基酸。由于人体自身不能合成,必须从食物中摄取,L-苏氨酸作为食品添加剂广泛应用于食品、饲料和医疗方面。最近几年，由于L-苏氨酸的作用十分广泛，国际市场对苏氨酸的需求高速增长，而未来苏氨酸的市场仍将快速增加，苏氨酸已成为需求量增长最快的氨基酸品类之一。目前L-苏氨酸的生产方法主要有微生物发酵法、蛋白质水解法、化学合成法3种，而现在微生物发酵法占有主流生产方法，具有节约资源，成本低，环境污染小等优点，已经广泛应用于工业生产中。随着生物科学技术的不断创新，工业微生物菌种广泛应用与各种生产中，特别是工业微生物载体系统的构建，为优良的L-苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产L-苏氨酸成为一种最优最佳的工业化生产方法。大肠杆菌产苏氨酸现在普遍运用到微生物发酵实验中，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点，但相对于氨基酸行业的需求，虽然产量稳定增加，但是速度还是比较慢。因此基因工程菌高产氨基酸的改造成为生产应用中的重中之重。大肠杆菌Ⅰ型菌毛由fim操纵子编码，包括fimA-fimH。本专利技术选择fimA基因进行分子研究，fimA基因是Ⅰ型菌毛的结构基因，由fimA基因编码的亚单位FimA是构成Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白，约占Ⅰ型菌毛总蛋白的95％以上。也是大肠杆菌生物膜的关键基因和毒力因子。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，提供一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，以提高大肠杆菌发酵制备L-苏氨酸的产量。本专利技术还要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术最后要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌在发酵制备L-苏氨酸中的应用。为解决上述问题，本专利技术提供如下技术方案：一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，所述的失活是指在该菌株中fimA基因失去编码得到正常蛋白质的功能，本专利技术实施中将大肠杆菌中fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，但选用其他基因替换fimA基因，或者在fimA基因中插入其他基因片段均可以使fimA基因失活，所述fimA基因序列如SEQIDNO：4所示。其中，所述大肠杆菌为CIBTS1688，大肠杆菌CIBTS1688赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌CIBTS1688已于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2015233，菌株号为CIBTS1688，其具体信息已在申请号为201510199036.1的专利技术专利中公开，其中，所述大肠杆菌的fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，替换后在大肠杆菌的基因组上原fimA基因被卡那霉素抗性基因替换。上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将质粒PKD46(其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示)电转入大肠杆菌CIBTS1688中，筛选出带有PKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；(2)以SEQIDNO：1～2所示的核苷酸序列为引物，以卡那霉素抗性基因为模板，PCR扩增得到得到打靶片段，所述打靶片段的基因序列如SEQIDNO：3所示，胶回收纯化打靶片段；(3)将步骤(2)纯化后的打靶片段电转入步骤(1)得到的的感受态细胞中，以卡那霉素为抗性标记，筛选得到敲除fimA基因的重组大肠杆菌。上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法构建得到的敲除fimA基因重组大肠杆菌在本专利技术的保护范围之内。上述述敲除fimA基因重组大肠杆菌在生产L-苏氨酸中的应用在本专利技术的保护范围之内。有益效果：fimA基因是大肠杆菌的毒力因子和I型菌毛蛋白的重要结构单位，通过对大肠杆菌I型菌毛的fimA基因敲除后，发现对发酵产L-苏氨酸有一定的促进作用，能增加L-苏氨酸的产量并且在可以缩短发酵周期，因此，对研究fimA基因以及fim基因家族对于L-苏氨酸的产量影响提供了理论和实践基础。附图说明图1PKD46质粒电泳图，其中泳道1和泳道2为PKD46质粒，泳道3为Marker。图2敲除片段fimA电泳图，其中泳道1为Marker，泳道2～8为fimA基因PCR图。图3CIBTS1688ΔfimA菌株菌落PCR验证，其中泳道1为Marker，泳道2为CIBTS1688菌fimA基因敲除前菌落PCR验证，泳道2为CIBTS1688ΔfimA菌株基因敲除后菌落PCR验证。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：构建fimA基因敲除菌株。1.制备大肠杆菌CIBTS1688受态细胞。(1)挑取大肠杆菌CIBTS1688单菌落，接种于5ml的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜，至对数生长后期。将该菌悬液以1:50的比例接种于50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.8-1.0。(2)在无菌条件下将培养液转入离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，然后4℃，4000rpm离心10min；(3)弃去上清，倒置1min，以便将培养液流尽；(4)用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液5ml轻轻悬浮细胞，充分混匀，冰上放置30min后，4℃下4000rpm离心10min；(5)弃去上清，并倒置1min，以便最后的痕量培养液流尽；(6)加入2.5ml预冷含30％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；感受态细胞200μL分装，贮存于-80℃保存备用。2.将质粒PKD46电转入大肠杆菌CIBTS1688感受态中，用氨苄抗性筛选出目的菌株。(1)将10ul的PKD46质粒加入到100ulCIBTS1688感受态细胞中，冰上预冷10min。(2)加入预冷的电转杯，条件25uF、200Ω、2.0kv电击。(4)电击完成立即加入900ulLB培养基，30℃，1h培养。(4)取100ul中的菌液涂LB抗性平板(氨苄霉素)，30℃过夜培养。(5)挑取单菌落，菌落PCR验证大肠杆菌CIBTS1688是否含有PKD46质粒。3.制备经过L-阿拉伯糖诱导的带有PKD46质粒的感受态细胞。(1)将带有质粒PKD46的大肠杆菌CIBTS1688菌株，命名为CIBTS1688PKD46。将此菌株接种于氨苄抗性的LB中，30℃过夜培养。(2)过夜培养后的菌液转接与100ml的氨苄抗性LB培养液中，30℃培养至OD＝0.6-0.8，并在培养终止前2h加入L-阿拉伯糖，终浓度1mmol/l。(3)将菌落分装，4℃4000rpm离心5min,收集菌体。(4)用预冷10％的甘油离心洗涤3次，浓缩100倍成1ml的感受态细胞，分装200ul，-80℃保存备用。4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，该大肠杆菌中的fimA基因失活。

【技术特征摘要】
1.一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，该大肠杆菌中的fimA基因失活。2.根据权利要求1所述的敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为CIBTS1688。3.根据权利要求1或2所述的敲除fimA基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌的fimA基因被卡那霉素抗性基因替换。4.权利要求1～3任一所述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将质粒PKD46电转入大肠杆菌CIBTS1688中，筛选出带有PKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，刘娜，陈勇，任培芳，奚迅，陈天鹏，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32