基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法；所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关基因的ORF序列或部分序列的缺失菌株。该方法首先成功构建带有Ngpiwi和待缺失靶基因序列左右同源臂的重组质粒；其次将重组质粒化学转化至牛源大肠杆菌中，在28℃传代诱导双交换重组，PCR筛选出缺失靶基因序列的菌株，之后在无抗生素培养基中37℃诱导质粒丢失，从而获得缺失潜在毒力基因相关序列的菌株。该遗传操作系统质粒较小，操作容易，应用广泛，不存在潜在的脱靶效应，敲除效率较高，无抗性基因筛选标记，为牛源大肠杆菌基因工程疫苗的研发提供了优良工具。

【技术实现步骤摘要】
基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法。
技术介绍
牛源大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌感染牦牛引起的以腹泻等为特征的疫病，该病的发病率约为10.1％，死亡率为2.5％，致死率为45％，严重威胁牦牛的健康及农户的经济利益，制约着西藏经济的健康、快速发展，常常给养殖户及农户造成难以估量的经济损失。大肠杆菌是严重危害牦牛养殖业的重要疾病之一，由于其血清型复杂和抗生素的大量使用所导致耐药菌株不断增加，对肠道正常菌群造成不良影响，给防治工作带来了巨大的挑战和困难，随着对抗生素滥用危害的重视，对于该病的预防必然依赖于好的生物安全防控措施和有效疫苗作为工具。目前农户多采用常规灭活疫苗，一般是采用流行的牦牛大肠杆菌强毒株制备全菌灭活疫苗，这类灭活疫苗安全性较好，不存在毒力返强等风险，但是也存在不能产生较好的交叉免疫保护，只对相同血清型的菌株感染具有免疫保护的效果。随着对大肠杆菌毒力基因的深入研究，开发基因工程弱毒疫苗将成为首要选择。相比较其他疫苗，基因缺失疫苗具有多项优势，针对性地敲除靶基因后，毒力明显减弱并且不存在毒力返强的风险，但却可以刺激宿主产生较高的体液免疫应答、细胞免疫应答及粘膜免疫应答，产生更好的免疫保护效力，还可以作为递呈异源抗原的载体，构建出重组载体疫苗，用途更加广泛。但遗憾的是，由于大肠杆菌基因组操作的困难，目前的基因组改造技术多采用的是抗性选择，即使毒力下降明显，也无法用作基因工程弱毒疫苗，这就限制了其开发为疫苗菌株的可能性。因此，构建牛源大肠杆菌基因敲除的无标记系统将是研制基因工程疫苗菌株的关键。有学者报道了一种新的基因编辑技术gDNA/NgAgo系统，该系统能表现出对核酸进行高效的切割，还有低脱靶效应、对靶位点错配的低容忍度以及易于设计和操作等优点。虽然对于该系统在真核生物中的基因编辑效应尚存在争议，但在牛源大肠杆菌中的效果并无研究。所以我们尝试该技术系统在牛源大肠杆菌中敲除aste基因等潜在的毒力相关基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法。本专利技术采用Ngpiwi蛋白构建了一套高效的、无分子标记的牛源大肠杆菌遗传操作系统。为实现上述目的，本专利技术所设计一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株，所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失菌株，所述潜在毒力相关序列为潜在毒力相关基因(putativevirulence-associatedgenes)的ORF序列或ORF的部分序列。进一步地，所述潜在毒力相关序列选自编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因(succinyl-glutamatedesuccinylase)ORF序列或ORF的部分序列，其中，编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。再进一步地，所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因(succinyl-glutamatedesuccinylase)ORF序列的缺失菌株，命名为Δaste-Ecoli。上述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建带有Ngpiwi基因的基础质粒pSHK5TS-NgPiwia.以NatronobacteriumgregoryiPiwi(NgPiwi)基因序列如SEQIDNo.2所示和ribosomebindingsite(RBS)片段序列如SEQIDNo.3所示为模板，设计引物对：NgPiwi的正反向扩增引物：NgPiwi-L：ATGACAGTGATTGACCTCGATTCG，NgPiwi-RH-R：GCAAGAAAAAATATCAATTAGAGGAATCCGACAT；RBS的正反向扩增引物：RBS-RH-L：TGTCGGATTCCTCTAATTGATATTTTTTCTTGC，RBS-R：TATGCACTCCTATTATTTAACTAAGTTGAC；分别扩增得到NgPiwi基因片段和RBS(核糖体结合位点)片段；b.然后将NgPiwi基因片段和RBS片段进行融合，得到融合产物NgPiwi-RBS，c.再将融合产物NgPiwi-RBS插入质粒PSHK5Ts的抗性基因Kan的启动子和编码区之间；构建得到带有NgPiwi基因的基础质粒pSHK5TS-NgPiwi；2)构建带有NgPiwi和带有左右同源臂的待缺失的潜在毒力相关序列RR的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；a.以待缺失的潜在毒力相关序列RR对应基因的ORF缺失部分序列及ORF序列上下游各1000bp以内的序列为模板，设计引物；b.扩增得到待缺失的潜在毒力相关序列RR的左右同源臂即为RR-LR，通过融合PCR将左右同源臂串联成单序列，将其与基础质粒pSHK5TS-NgPiwi进行酶切、酶连，PCR鉴定筛选出正确的转化子，提取转化子质粒后进行酶切和测序鉴定，获得带有NgPiwi基因的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；3)牛源大肠杆菌基因敲除菌株将pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR用CaCl2法转化至牛源大肠杆菌感受态细胞中，进行PCR鉴定，筛选得到携带目的质粒的菌株；并传代培养，利用NgPiwi介导的同源重组，获得潜在毒力相关序列RR的双交换菌株；最后将上述获得的潜在毒力相关序列RR的双交换菌株无抗生素条件下进行37度培养，诱导质粒丢失，从而获得牛源大肠杆菌RR基因序列敲除菌株，即为：RR基因序列敲除的菌株ΔRR-Ecoli。进一步地，所述待缺失的潜在毒力相关序列RR选自编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因(succinyl-glutamatedesuccinylase)ORF序列或ORF的部分序列。再进一步地，所述步骤2)中，待缺失的潜在毒力相关序列RR为编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列或ORF的部分序列时，以编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列及上下游各1000bp序列如SEQIDNo.4所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物：astE-L-SacI-1：TTGAGCTCTTGTTCTGGGTTTCCATGTGC，astE-L-2：GGAGGGGGCAATGGATTAATACTTACCCGCAGAAATC；右同源臂正反向引物：astE-R-3：TCTGCGGGTAAGTATTAATCCATTGCCCCCTCCCTCGC，astE-R-BamHI-4：TTGGATCCCTTTTTGTCTACGGGCGAGAAG；上述牛源大肠杆菌编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因敲除菌株Δaste-Ecoli的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建牛源大肠杆菌靶基因敲除的基础质粒pSHK5Ts-NgPiwi的具体方法，包括以下步骤：a.分别以SEQIDNo.2和SEQIDNo.3为模板设计NgPiwi片段和RBS片段扩增融合引物以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株，其特征在于：所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失菌株，所述潜在毒力相关序列为潜在毒力相关基因的ORF序列或ORF的部分序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株，其特征在于：所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失菌株，所述潜在毒力相关序列为潜在毒力相关基因的ORF序列或ORF的部分序列。2.根据权利要求1所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株，其特征在于：所述潜在毒力相关序列选自编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因的ORF序列或ORF的部分序列，其中，编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因的ORF序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1或2所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株，其特征在于：所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因的ORF序列的缺失菌株，命名为ΔastE-Ecoli，其中，编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因的ORF序列如SEQIDNo.1所示。4.一种权利要求1所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建带有Ngpiwi基因的温敏自杀基础质粒pSHK5TS-NgPiwi；a.以NatronobacteriumgregoryiPiwi基因序列如SEQIDNo.2所示和ribosomebindingsite片段序列如SEQIDNo.3所示为模板，设计引物对：NgPiwi的正反向扩增引物：NgPiwi-L：ATGACAGTGATTGACCTCGATTCG，NgPiwi-RH-R：GCAAGAAAAAATATCAATTAGAGGAATCCGACAT；RBS的正反向扩增引物：RBS-RH-L：TGTCGGATTCCTCTAATTGATATTTTTTCTTGC，RBS-R：TATGCACTCCTATTATTTAACTAAGTTGAC；分别扩增得到NgPiwi基因片段和RBS片段；b.然后将NgPiwi基因片段和RBS片段进行融合，得到融合产物NgPiwi-RBS，c.再将融合产物NgPiwi-RBS插入质粒PSHK5Ts的抗性基因Kan的启动子和编码区之间；构建得到带有NgPiwi基因的基础质粒pSHK5TS-NgPiwi；2)构建带有NgPiwi和带有左右同源臂的待缺失的潜在毒力相关序列RR的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；a.以待缺失的潜在毒力相关序列RR对应基因的ORF缺失部分序列及ORF序列上下游各1000bp以内的序列为模板，设计引物；b.扩增得到待缺失的潜在毒力相关序列RR的左右同源臂即为RR-LR，通过融合PCR将左右同源臂串联成单序列，将其与基础质粒pSHK5TS-NgPiwi进行酶切、连接，PCR鉴定筛选出正确的转化子，提取转化子质粒后测序鉴定，获得带有NgPiwi基因的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；3)牛源大肠杆菌基因敲除菌株将pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR用CaCl2法转化至牛源大肠杆菌感受态中，进行PCR鉴定，筛选得到携带目的质粒的菌株；并传代培养，利用NgPiwi介导的同源重组，获得潜在毒力相关序列RR的双交换菌株；最后将上述获得的潜在毒力相关序列RR的双交换菌株无抗生素条件下进行培养，诱导质粒丢失，从而获得牛源大肠杆菌RR基因序列敲除菌株，即为：RR基因序列敲除的菌株ΔRR-Ecoli。5.根据权利要求4所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中，待缺失的潜在毒力相关序列RR选自编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列。6.根据权利要求4或5所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中，a.待缺失的潜在毒力相关序列RR为编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列或ORF的部分序列时，以编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列及上下游各1000bp序列如SEQIDNo.4所示为模板，设计引物对：左同源臂正反向引物：astE-L-SacI-1：TTGAGCTCTTGTTCTGGGTTTCCATGTGC，astE-L-2：GGAGGGGGCAATGGATTAATACTTACCCGCAGAAATC；右同源臂正反向引物：astE-R-3：TCTGCGGGTAAGTATTAATCCATTGCCCCCTCCCTCGC，astE-R-BamHI-4：TTGGATCCCTTTTTGTCTACGGGCGAGAAG。7.一种权利要求3所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株ΔastE-Ecoli的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建牛源大肠杆菌靶基因敲除的基础质粒pSHK5Ts-NgPiwi的具体方法，包括以下步骤：a.分别以SEQIDNo.2和SEQIDNo.3为模板设计NgPiwi片段和RBS片段扩增融合引物以及NgPiwi片段的鉴定引物；分别为：NgPiwi的正反向扩增引物：NgPiwi-L：ATGACAGTGATTGACCTCGATTCG，NgPiwi-RH...

【专利技术属性】
技术研发人员：张安定，付磊，韩丽，靳泽华，周红波，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42