DNA微囊及金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用技术

本发明专利技术公开了一种DNA微囊及金电极‑DNA树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用。首先将亚甲基蓝(MB)负载在碳酸钙微粒上；利用PAH包被负载了MB的碳酸钙微粒，再将PAH包被的微粒在核酸启动子S1溶液中孵育，在微粒的表面结合上核酸启动子S1；然后继续在DNA S2溶液中进行孵化，利用S1、S2碱基序列的配对继续在S1的外层结合上DNA S2；然后利用EDTA将碳酸钙模板核心溶解掉而制备得到DNA微囊。然后基于目标物PCB‑72触发DNA微囊释放亚甲基蓝信号分子及互补DNA引发非线性杂交链式反应构建出金电极‑DNA树枝状大分子传感器进而实现对多氯联苯的超灵敏检测，该方法具有检测限低、灵敏度高、选择性好、稳定性好的特点。

Preparation of DNA Microencapsulation and Gold Electrode-DNA Dendrimer Sensor and Its Application in Detection of Polychlorinated Biphenyls

The invention discloses a preparation method of DNA microcapsule and gold electrode DNA dendrimer sensor and its application in the detection of polychlorinated biphenyls. First, methylene blue (MB) was loaded on calcium carbonate particles, then PAH-coated calcium carbonate particles were incubated in the solution of nucleic acid promoter S1 and bound to nucleic acid promoter S1 on the surface of the particles, and then continued to incubate in the solution of DNA S2. DNA S2 was bound to the outer layer of S1 by pairing of S1 and S2 base sequences, and then DNA S2 was bound by EDTA. DNA microcapsules were prepared by dissolving the core of calcium carbonate template. Then, a gold electrode DNA dendrimer sensor was constructed based on the target PCB 72 triggering DNA microcapsules to release methylene blue signal molecule and complementary DNA triggering non-linear hybridization chain reaction to realize the ultra-sensitive detection of polychlorinated biphenyls. The method has the characteristics of low detection limit, high sensitivity, good selectivity and good stability.

【技术实现步骤摘要】
DNA微囊及金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用
本专利技术属于电化学传感器
，具体涉及一种DNA微囊及金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用，具体涉及一种基于目标物PCB-72触发DNA微囊释放亚甲基蓝信号分子及互补DNA引发非线性杂交链式反应构建出金电极-DNA树枝状大分子传感器进而实现对多氯联苯的超灵敏检测。
技术介绍
多氯联苯(PCBs)是一种持久性的有机化学污染物，虽然作为热载体、绝缘油、润滑油等在工业中得到了广泛应用，却会造成严重的环境污染问题。PCBs不仅很难分解，而且会通过皮肤、呼吸道、消化道被人体吸收。严重危及到人们的生存与健康。甚至超痕量的PCBs也会在人体组织中富集。当前出现的高效分析检测PCBs有气相色谱/高分辨率质谱(GC/HRMS)、气相色谱/电子捕获检测器(GC/ECD)、高效液相色谱/光电二极管阵列(HPLC/PDA)等方法通常需要复杂的设备以及熟练的操作技术。因此，与免疫认知以及不同信号资料(如荧光、电化学、比色等)相联系的更新颖、简便、高效的生物传感技术被运用于PCBs的检测中。但由于抗体的处理繁琐且昂贵，且抗体对温度变化比较敏感，存活的时间较短，因此用免疫传感器检测PCBs有很大的局限性。而DNA适配体由于成本低，易合成等特点在分子识别和生物传感器方面有较好的应用前景，特别是有科研团队首次筛选出多聚联苯的适配体，已有一些基于比色、荧光、表面增强拉曼等研究方法的出现，但依旧存在着检测灵敏度低，检测范围窄。而出现的电化学方法都是存在着昂贵的标记成本和复杂的修饰过程。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种DNA微囊及金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用。基于目标物PCB-72触发DNA微囊释放亚甲基蓝信号分子及互补DNA引发非线性杂交链式反应构建出金电极-DNA树枝状大分子传感器进而实现对多氯联苯的超灵敏检测。本专利技术采取的技术方案为：一种DNA微囊的制备方法，包括以下步骤：(1)制备亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒；(2)将亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒悬浮在聚羟基脂肪酸溶液中，吸附一段时间后，经洗涤、离心，制备得到PAH包被的微粒；(3)将PAH包被的微粒和与PAH共轭的核酸启动子DNAS1溶液一起孵育，然后经洗涤、离心之后，再次与DNAS2溶液一起孵育，经洗涤、离心，制备得到DNA-PAH凝胶颗粒；(4)将DNA-PAH凝胶颗粒加入到EDTA溶液中孵育以溶解掉碳酸钙模板核心，然后经洗涤离心之后，得到所述DNA微囊，将DNA微囊储存在HEPES缓冲液得到DNA微囊溶液。步骤(3)中，所述核酸启动子DNAS1的基因序列为：5'-TTT-TTC-ACT-CGG-ACC-CCA-TTC-TCC-TTC-CAT-CCC-TCA-TCC-GTC-CAC-CAT-CAA-CTA-GTT-3'；双划线处为核酸适配体识别区；所述DNAS2的基因序列为：5'-AAC-TAG-TTG-ATG-AAG-CTG-GAC-ATAA-TAG-GCA-CAC-GAC-ATAA-TAG-GCA-CAC-3'。步骤(3)中，所述核酸启动子DNAS1溶液的制备方法为：将核酸启动子DNAS1溶解在缓冲溶液B中配制得到0.1μM的核酸启动子DNAS1溶液；并按照相同的方法配制得到0.1μM的DNAS2溶液；所述缓冲溶液B的成分为：25mMTris、100mMNaCl和10mMMgCl2；所述缓冲溶液B的pH为7.4；所述步骤(3)中的孵育时间均为30min。步骤(4)中，所述EDTA溶液的浓度为0.5M，所述孵育的时间为1h；所述DNA微囊溶液中的微粒浓度为10mM。本专利技术还提供了所述的制备方法制备得到的DNA微囊在制备金电极-DNA树枝状大分子传感器和定量检测多氯联苯(PCB-72)中的应用。本专利技术还提供了一种金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法，包括以下步骤：(a)将金电极经抛光预处理之后，在DNAS3溶液中孵育，清洗之后，再将其置于6-巯基己醇溶液中孵育，经洗涤、干燥之后，得到S3探针修饰的金电极；(b)将多氯联苯(PCB-72)加入到上述制备方法制备得到的DNA微囊溶液中，制备得到含有PCB-72的DNA微囊溶液；(c)将步骤(a)处理之后的金电极在含有PCB-72的DNA微囊溶液进行孵育；(d)将DNAS4溶液和DNAS5溶液按照体积比1:1进行混合得到杂交溶液Ⅰ，并将步骤(c)处理之后的金电极在杂交溶液Ⅰ中孵育；(e)将DNAS6溶液和DNAS7溶液按照体积比1:1进行混合得到杂交溶液Ⅱ，并将步骤(d)处理之后的金电极在杂交溶液Ⅱ中孵育；即可得到金电极-DNA树枝状大分子传感器。所述DNAS3的基因序列为：5'-GTG-TGC-CTA-TTA-TGT-CTC-CTC-CTG-TGT-GCC-TAT-TAT-GTC-TCC-TCC-TCA-GCT-TCA-TCA-ACT-AGT-TCG-TCA-(CH2)6-SH-3'；所述DNAS4的基因序列为：5'-TGA-CGA-ACT-AGT-TGA-TGA-AGC-TG-3'；所述DNAS5的基因序列为：5'-GTGCCTATTATGTCGTGTGCCTATTATGTCCAGCTT-3'；所述DNAS6的基因序列为：5'-AGGAGGAGACATAATAGGCACACTGACGAACTAGTTGATGAAGCTG-3'；所述DNAS7的基因序列为：5'-GTG-TGC-CTA-TTA-TGT-CTC-CTC-CTG-TGT-GCC-TAT-TAT-GTC-TCC-TCC-TCA-GCT-TCA-TCA-ACT-AGT-TCG-TCA-3'。所述DNAS3、S4、S5、S6、S7溶液的制备方法均与核酸启动子DNAS1溶液相同；所述DNAS3、DNAS4、DNAS5溶液的浓度均为0.1μM；所述DNAS6、DNAS7溶液的浓度均为0.5μM。所述步骤(a)中，所述6-巯基己醇溶液的浓度为2mM；金电极在DNAS3溶液中孵育时间为10h；金电极在6-巯基己醇溶液中的孵育时间为30min。所述步骤(b)中，PCB-72在DNA微囊溶液中的浓度为10ng/L。所述步骤(c)中，金电极在含有PCB-72的DNA微囊溶液中的孵育时间为30min。所述步骤(d)中，金电极在杂交溶液Ⅰ的孵育时间为30min。所述步骤(e)中，金电极在杂交溶液Ⅱ的孵育时间为2.0h。步骤(a)～(e)中的温育温度均为37℃。本专利技术还提供了一种多氯联苯(PCB-72)的定量检测方法，包括以下步骤：(A)将多组金电极经抛光预处理之后，分别在DNAS3溶液中孵育1h，清洗之后，再将其置于6-巯基己醇溶液中孵育30min，经洗涤、干燥之后，得到多组S3探针修饰的金电极；(B)分别将多氯联苯(PCB-72)加入到上述制备方法制备得到的DNA微囊溶液中，制备得到一系列含有不同PCB-72浓度的DNA微囊溶液；(C)分别将步骤(A)处理之后的各组金电极在不同PCB-72浓度的DNA微囊溶液中进行孵育30min；(D)将DNAS4溶液和DNAS5溶液按照体积比1:1进行混合得到杂交溶液Ⅰ，并将步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒；(2)将亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒悬浮在聚羟基脂肪酸溶液中，吸附一段时间后，经洗涤、离心，制备得到PAH包被的微粒；(3)将PAH包被的微粒和与PAH共轭的核酸启动子DNA S1溶液一起孵育，然后经洗涤、离心之后，再次与DNA S2溶液一起孵育，经洗涤、离心，制备得到DNA‑PAH凝胶颗粒；(4)将DNA‑PAH凝胶颗粒加入到EDTA溶液中孵育以溶解掉碳酸钙模板核心，然后经洗涤离心之后，得到所述DNA微囊，将DNA微囊储存在HEPES缓冲液得到DNA微囊溶液。

【技术特征摘要】
1.一种DNA微囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒；(2)将亚甲基蓝负载的碳酸钙微粒悬浮在聚羟基脂肪酸溶液中，吸附一段时间后，经洗涤、离心，制备得到PAH包被的微粒；(3)将PAH包被的微粒和与PAH共轭的核酸启动子DNAS1溶液一起孵育，然后经洗涤、离心之后，再次与DNAS2溶液一起孵育，经洗涤、离心，制备得到DNA-PAH凝胶颗粒；(4)将DNA-PAH凝胶颗粒加入到EDTA溶液中孵育以溶解掉碳酸钙模板核心，然后经洗涤离心之后，得到所述DNA微囊，将DNA微囊储存在HEPES缓冲液得到DNA微囊溶液。2.根据权利要求1所述的DNA微囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述核酸启动子DNAS1的基因序列为：5'-TTT-TTC-ACT-CGG-ACC-CCA-TTC-TCC-TTC-CAT-CCC-TCA-TCC-GTC-CAC-CAT-CAA-CTA-GTT-3'；所述DNAS2的基因序列为：5'-AAC-TAG-TTG-ATG-AAG-CTG-GAC-ATAA-TAG-GCA-CAC-GAC-ATAA-TAG-GCA-CAC-3'。3.根据权利要求1所述的DNA微囊的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述核酸启动子DNAS1溶液的制备方法为：将核酸启动子DNAS1溶解在缓冲溶液B中配制得到0.1μM的核酸启动子DNAS1溶液；并按照相同的方法配制得到0.1μM的DNAS2溶液；所述缓冲溶液B的成分为：25mMTris、100mMNaCl和10mMMgCl2；所述缓冲溶液B的pH为7.4；所述步骤(3)中的孵育时间均为30min。4.根据权利要求1所述的DNA微囊的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述EDTA溶液的浓度为0.5M，所述孵育的时间为1h；所述DNA微囊溶液中的微粒浓度为10mM。5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法制备得到的DNA微囊在制备金电极-DNA树枝状大分子传感器和定量检测多氯联苯(PCB-72)中的应用。6.一种金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将金电极经抛光预处理之后，在DNAS3溶液中孵育，清洗之后，再将其置于6-巯基己醇溶液中孵育，经洗涤、干燥之后，得到S3探针修饰的金电极；(b)将多氯联苯(PCB-72)加入到根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法制备得到的DNA微囊溶液中，制备得到含有PCB-72的DNA微囊溶液；(c)将步骤(a)处理之后的金电极在含有PCB-72的DNA微囊溶液进行孵育；(d)将DNAS4溶液和DNAS5溶液按照体积比1:1进行混合得到杂交溶液Ⅰ，并将步骤(c)处理之后的金电极在杂交溶液Ⅰ中孵育；(e)将DNAS6溶液和DNAS7溶液按照体积比1:1进行混合得到杂交溶液Ⅱ，并将步骤(d)处理之后的金电极在杂交溶液Ⅱ中孵育；即可得到金电极-DNA树枝状大分子传感器。7.根据权利要求5所述的金电极-DNA树枝状大分子传感器的制备方法，其特征在于，所述DNAS3的基因序列为：5'-GTG-TGC-CTA-TTA-TG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，韩挺，王思成，盛非凡，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34