本发明专利技术涉及一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用，复合物为β-环糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。将制备的G5.NH2-β-CD的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应，然后加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应，透析，冷冻干燥，即得。复合物Au DENPs-β-CD作为非病毒载体负载siRNA进行基因转染的应用。本发明专利技术转染过程易于操作，生物相容性好，转染效率高，生物医学方面具有良好的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米复合物及其制备和应用领域，特别涉及一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是指由与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)引发而导致特异性基因转录后出现基因沉默的现象。在细胞内，dsRNA特异性的核酸酶将其裂解成不超过21-25个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)，随后介导特异性的mRNA发生降解，导致相应基因表达被阻断而引起基因沉默。该技术已被广泛应用于基因治疗的研究中。基因治疗作为一种现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术，是通过将外源正常基因导入靶细胞内，用以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病，从而进行疾病治疗。然而，目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的载体。在基因载体系统中，主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体转染效率高，但临床应用的安全隐患制约了其进一步的应用。而非病毒载体，由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点，越来越受到研究者们的关注。非病毒载体中，聚酰胺胺树状大分子(PAMAM)是目前研究最深入的树状大分子之一，它独特的高度支化三维立体结构令其成为一种新型的高分子载体被广泛应用于基因传递中。研究表明，PAMAM的基因转染效率和细胞毒性会随着其代数的增加而增加。而第五代(G5)PAMAM虽然有一定的毒性，但可以通过内部包裹纳米金颗粒[Shan,Y.,Luo,T.,etal.,Genedeliveryusingdendrimer-entrappedgoldnanoparticlesasnonviralvectors[J].Biomaterials,2012,33(10):p.3025-3035]或进行表面修饰[史向阳，侯文秀，郭睿，孔令丹.包裹纳米金颗粒的PEG功能化的PAMAM树状大分子载体的基因转染方法[P].中国专利：201310728846.2，2014-04-09]等手段降低其细胞毒性并增强转染能力。Wang等[Wang,H.,N.Shao,etal.,Host-guestchemistryofdendrimer-cyclodextrinconjugates:SelectiveencapsulationsofguestswithindendrimerorcyclodextrincavitiesrevealedbyNOENMRtechniques[J].JPhysChemB,2012,116(36):p.11217-11224.]证明，将环糊精分子共价连接到G5PAMAM表面，可以增强G5PAMAM的水溶性及细胞摄入率。检索国内外相关文献和专利结果表明：以β-CD修饰的树状大分子及其纳米金颗粒为载体，负载siRNA用于恶性胶质瘤细胞(U87MG)基因转染的方法，尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物及其制备和应用，本专利技术制备过程简单，实验条件温和，易操作；本专利技术所得复合物具有较好的生物相容性及基因转染效率。本专利技术的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物，所述复合物为β-环糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。本专利技术的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，包括：(1)分别将N,N’-羰基二咪唑CDI和β-环糊精β-CD溶解于溶剂中，混匀4-6h，得到混合液，然后向混合液中逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液，继续室温搅拌1-3天，经透析，冷冻干燥，得到白色粉末G5.NH2-β-CD；其中CDI与β-CD的摩尔比为5：1～10：1，β-CD与G5.NH2的摩尔比为25：1；(2)在剧烈搅拌条件下，将G5.NH2-β-CD的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应20-30min，然后迅速加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应2-4h，透析，冷冻干燥，得到β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物AuDENPs-β-CD；其中G5.NH2与HAuCl4·4H2O的摩尔比为1：25，HAuCl4·4H2O与NaBH4的摩尔比为1：5～1：10。步骤(1)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜DMSO。步骤(1)中N,N’-羰基二咪唑CDI溶解于溶剂中的浓度为111.36μmol/mL，β-环糊精β-CD溶解于溶剂中的浓度为11.14μmol/mL；(不是在混合液中的浓度，是溶解于DMSO溶剂中的浓度)第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的浓度为0.44μmol/mL；第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO。步骤(2)中氯金酸水溶液的浓度为30mg/mL；硼氢化钠NaBH4的冰水溶液浓度为10mg/mL。步骤(2)中溶液的溶剂均为超纯水。步骤(1)、(2)中透析均为：使用的透析袋截留分子量为8000-14000；用PBS缓冲溶液透析1天后更换超纯水透析2天，每天3次，每次2L。本专利技术的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的应用，β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物AuDENPs-β-CD作为非病毒载体负载siRNA进行基因转染的应用。AuDENPs-β-CD作为载体应用于恶性胶质瘤细胞U87MG基因转染，具体为：按照不同N/P比，取无菌水分别稀释AuDENPs-β-CD及siRNA，而后均匀混合，于37℃条件孵育15-30min，得到不同N/P比的AuDENPs-β-CD/siRNA复合物；将U87MG细胞于37℃、5％CO2培养24h，更换无血清的DMEM培养基，加入不同N/P比的AuDENPs-β-CD/siRNA复合物溶液，37℃培养4h进行基因转染；其中N/P比为第五代聚酰胺-胺树状大分子的表面氨基基团与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。所述siRNA为B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)siRNA或血管内皮生长因子VEGFsiRNA。不同N/P比分别为2.5：1、5：1和10：1。本专利技术将β-CD与G5PAMAM表面氨基基团共价结合，可以通过中和其部分表面氨基以降低材料的细胞毒性，并提高材料的生物相容性。本专利技术将HAuCl4·4H2O加入到含G5PAMAM的溶液中，快速搅拌使HAuCl4·4H2O与G5PAMAM充分混合，后快速加入NaBH4还原得到纳米金颗粒，避免了纳米金颗粒的聚集。本专利技术以β-CD修饰聚酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β‑环糊精/聚酰胺‑胺树状大分子/金纳米颗粒复合物，其特征在于：所述复合物为β‑环糊精β‑CD与第五代聚酰胺‑胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。
【技术特征摘要】
1.一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物，其特征在于：所述复合物为β-环
糊精β-CD与第五代聚酰胺-胺树状大分子表面氨基基团共价结合并负载金纳米颗粒。
2.一种如权利要求1所述的β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方法，
包括：
(1)分别将N,N’-羰基二咪唑CDI、β-环糊精β-CD溶解于溶剂中后，混匀4-6h，得到混合
液，然后向混合液中逐滴加入第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液，继续室温搅
拌1-3天，经透析，冷冻干燥，得到G5.NH2-β-CD；其中CDI与β-CD的摩尔比为5:1-10:1，
β-CD与G5.NH2的摩尔比为25:1；
(2)在搅拌条件下，将G5.NH2-β-CD的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反应20-30min，
然后加入硼氢化钠NaBH4的冰水溶液，继续反应2-4h，透析，冷冻干燥，得到β-环糊
精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物AuDENPs-β-CD；其中G5.NH2与
HAuCl4·4H2O的摩尔比为1：25，HAuCl4·4H2O与NaBH4的摩尔比为1：5～1：10。
3.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方
法，其特征在于：步骤(1)中的溶剂为二甲基亚砜DMSO。
4.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合物的制备方
法，其特征在于：步骤(1)中N,N’-羰基二咪唑CDI溶解于溶剂后的浓度为111.36μmol/mL，
β-环糊精β-CD溶解于溶剂后的浓度为11.14μmol/mL；第五代聚酰胺-胺树状大分子
G5.NH2溶液的浓度为0.44μmol/mL；第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液的溶剂为
二甲基亚砜DMSO。
5.根据权利要求2所述的一种β-环糊精/聚酰胺-胺树状大分子/金纳米颗粒复合...
【专利技术属性】
技术研发人员：史向阳，邱洁茹，孔令丹，李爱军，曹雪雁，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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