具有增强的β-葡糖苷酶活性的高产里氏木霉菌株制造技术

本发明专利技术涉及一种高产并且具有增强的β‑葡糖苷酶活性的里氏木霉菌株，以及所述菌株的用途。

【技术实现步骤摘要】
具有增强的β-葡糖苷酶活性的高产里氏木霉菌株
本专利技术涉及一种高产并且具有增强的β-葡糖苷酶活性的里氏木霉菌株，以及所述菌株的用途。
技术介绍
里氏木霉(T.reesei)是一种分解纤维素的木霉属丝状真菌种，其在第二次世界大战期间在南太平洋被发现。该真菌能够分泌大量纤维素类的酶(纤维素酶和半纤维素酶)，目前主要用于第二代生物燃料的生产过程。实际上，由该真菌产生的酶特别适用于将植物生物质材料转化为可用于工业的生物产物，例如生物乙醇。鉴于第一代生物燃料(来源于食物资源)只能以有限数量生产，因为它们与食品生产竞争，因此目前特别关注第二代生物燃料(来源于非食物资源)。第二代生物燃料的生产过程包括四个主要步骤：木质纤维素生物质的预处理，木质纤维素生物质的酶促水解、发酵和蒸馏。虽然生产第二代生物燃料的所有步骤都可以而且必须进行优化-以便增加产量-但是特别努力集中在酶促水解步骤上。该水解步骤涉及由丝状真菌里氏木霉产生的纤维素酶类型的酶。更通常地，里氏木霉可以用作平台菌株来生产目标同源或异源蛋白质。为了优化里氏木霉的性能，必须增强产生目标蛋白质的里氏木霉菌株。因此，在所预期的增强方法中，里氏木霉的基因工程是一种解决方案。它可以在工业条件下增强产纤维素酶丝状真菌的分泌性能、酶的性质，并控制菌株的稳定性。诱变是基因工程中常用的技术。它旨在自发地在DNA中引入突变以产生遗传修饰的基因。从工业角度来看，这可以产生具有令人感兴趣特征的菌株。常规使用两种诱变方法在里氏木霉中引入突变：随机诱变和定向诱变。随机诱变包括在DNA中的任何地方诱导非靶向突变。通过将靶生物暴露于诱变化学剂或辐射来引发这些突变。鉴于突变是一种自然现象，因此随机诱变被认为是这种自然过程的加速器，由此获得的生物被认为是天然的而不是转基因生物(GMO)；因此，它们不受制于可追溯性要求。然而，除了导致目标特征的突变之外，该方法还诱导大量不期望的所谓“附带”突变，其通过积累而促成突变生物的不稳定性、健康不良或甚至致命性。定向诱变可以将经鉴定的突变引入特定基因。为此目的，合成含有突变的目标DNA，然后将其引入待突变的细胞中，其中DNA修复机制负责将其整合入基因组中。选择标记的使用使得可以从未整合突变的细胞中鉴定已经整合突变的细胞。然而，经历这种诱变的生物被认为是GMO(由于引入了外源DNA)，因此受制于可追溯性要求。因此，在使用里氏木霉生产第二代生物燃料的情况下，通过将(随机或定向)突变引入里氏木霉来增强水解步骤并不能令人满意，因为引起不希望的突变的积累，或者实际上是引入了外源DNA。因此，需要一种增强水解步骤的新方法。迄今为止，里氏木霉的有性繁殖从未被用作增强工具，因为一直认为里氏木霉不能进行有性繁殖。然而，里氏木霉有性状态的发现(Seidl等，2009)为菌株的遗传增强开辟了新的可能性。尤其是，有性繁殖使得可以产生遗传多样性、保留有益突变并从基因组中去除“附带”突变。因此，本专利技术的专利技术人试图通过有性繁殖，特别是通过将里氏木霉的野生菌株和工业菌株杂交来开发里氏木霉的分解纤维素的性能。
技术实现思路
因此，本专利技术基于本专利技术人的发现，其主要贡献在于在无数次试验后获得高产纤维素分解酶的新型里氏木霉菌株。如实施例1中所述，该菌株通过将纤维素酶高产菌株RutC30(Montenecourt和Eveleigh，1977)与菌株A2(衍生自来源于自育菌株CBS999.97的分离的子囊孢子的菌株)杂交而获得。令人惊讶的是，在根据本专利技术的菌株产生的纤维素分解酶中，酶β-葡糖苷酶表现出增强的活性(与亲本RutC30和A2的活性相比)。根据本专利技术的菌株也是MAT1-1交配型并且是可育的。因此，在第一方面，本专利技术涉及于2017年8月3日以保藏号CNCMI-5221保藏于CNCM的里氏木霉菌株。该菌株在实施例中称为RuA-149，并且还是“根据本专利技术的菌株”。CNCM是巴斯德研究所的国家微生物保藏中心，位于25rueduDocteurRoux,F-75724Pariscedex15。所述菌株有利地是纤维素分解酶的高产菌株，特别是纤维素酶例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡糖苷酶的高产菌株。更具体地，根据本专利技术的“酶的高产菌株”是其中纤维素分解酶，特别是纤维素酶的产率相对于菌株RutC30(RutC30菌株为参考高产菌株(Montenecourt和Eveleigh，1977))为81％-250％的菌株。术语“81％-250％”表示81-250的所有值，例如90、100、10、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230和240。在一个实施方案中，根据本专利技术的菌株产生约30g/L的蛋白质，优选约34g/L(用Lowry方法进行的测定，参见Lowry等人)。菌株的纤维素酶产率可以使用本领域技术人员的任何常规技术，例如以下方案测定：-将菌株在微板中与2mL纤维素酶诱导培养基(例如由MSDS以参考号：9004-34-6销售的)一起培养。-培养7天后，根据Bradford方法通过测定上清液中分泌的总蛋白质的量来测量纤维素酶的产率。可制定总分泌蛋白和纤维素酶之间的相关性，因为在里氏木霉中，主要的外切葡聚糖酶(CBHI、CBHII)和内切葡聚糖酶(EGI、EGII)可占分泌的蛋白质总量的高达90％(例如参见Markov等，2005)。有利地，根据本专利技术的所述菌株还具有增强的β-葡糖苷酶活性。术语“增强的β-葡糖苷酶活性”表示优于菌株RutC30(56765)的β-葡糖苷酶活性，优选比RutC30的β-葡糖苷酶活性大约三倍。根据一个实施方案，所述菌株具有至少0.53IU/mg，优选至少1.33±0.09IU/mg的β-葡糖苷酶活性。获得增强的β-葡糖苷酶活性使得可以增强酶鸡尾酒(包含内切/外切葡聚糖酶和葡糖苷酶，例如β-葡糖苷酶)的性能，因为它是纤维素降解的限制酶。可以使用本领域技术人员的任何常规技术测定β-葡糖苷酶活性，例如下文所述的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的水解：-测定培养上清液的β-葡萄糖苷酶活性。将测定的样品稀释于补充有0.5g/L牛血清白蛋白的50mM柠檬酸盐缓冲液中以获得浓度为约50-100mg/L的蛋白质；-将10μL稀释液和90μL在pH4.8的50mM柠檬酸盐缓冲液中制备成5mM的pNPG底物加入1.5mL试管中；-将试管孵育30分钟至50℃；-向试管中加入100μL的2％Na2CO3；-孵育20分钟后，在410nm处读取光密度(吸光度)；-使用一系列25、50、100和200μM补充有0.5g/LBSA的50mM柠檬酸盐缓冲液计算释放的对硝基苯酚的当量浓度。根据本专利技术的所述菌株是MAT1-1交配型。因此，该菌株具有与所有工业菌株相容的优点。实际上，所有工业菌株都产生自作为MAT1-2交配型的天然分离物QM6a，它们都是MAT1-2雌性不育但雄性可育的交配型。根据本专利技术的所述菌株也是雌性可育的，即当与MAT1-2雌性不育菌株杂交时，它能够分化结实器官并系统地发出子囊孢子(子囊菌真菌如里氏木霉的生殖细胞)。根据本专利技术的所述菌株也是雄性可育的。根据本专利技术的所述菌株还具有不被认为是转基因生物(GMO)的优点，因此不受限于可追本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.于2017年8月3日以保藏号CNCM I‑5221保藏于CNCM的里氏木霉菌株。

【技术特征摘要】
2017.09.29 FR 17591441.于2017年8月3日以保藏号CNCMI-5221保藏于CNCM的里氏木霉菌株。2.根据权利要求1的菌株用于产生纤维素分解酶，特别是纤维素酶，更特别是β-葡糖苷酶的用途。3.根据权利要求1的菌株用于将纤维素或木质纤维素水解成葡萄糖的用途。4.根据权利要求1的菌株用于从葡萄糖生产生物来源的产品的用途。5.一种生产生物来源的产品的方法，包括使用根据权利要求1的里氏木霉菌株产生的纤维素分解酶。6.根据权利要求1的菌株用于生产生物燃料的用途。7.一种从纤维素或木质纤维素底物生产生物燃料的方法，包括使用根据权利要求1的里氏木霉菌株产生的纤维素分解酶。8.根据权利要求7的从纤维素或木质纤维素底物生产生物燃料的方法，包括：-纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·比达德米彻洛，L·钱·奥·童，A·马尔若，C·科亨，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR