一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养；S2固定化细胞制备；S3固定化细胞通电培养；S4发酵产酶培养；S5酶制剂分离纯化；S6循环利用。本发明专利技术利用固定化细胞技术将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌共同固定在载体颗粒中，进行混合发酵来生产饲用酶制剂，各菌株之间互利共生，产出的酶种类丰富，与单独发酵生产各酶种，然后再复配相比，能简化生产工艺，缩短生产周期，大大提高生产效率。制备的固定化细胞颗粒稳定性好，易于分离回收，可循环利用产酶，大大降低生产成本，在饲用酶制剂生产领域具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法
本专利技术属于饲料添加剂生产领域，具体涉及一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法。
技术介绍
饲用酶制剂是一种以酶为主要功能因子的饲料添加剂，其中酶的来源包括植物、动物和微生物等，可以通过提取获得，也可以发酵加工得来。研究表明，饲用酶制剂对动物是无毒、无害、无残留的，不会对动物产生负面影响。首先酶制剂的本质是蛋白质，进入动物消化道发挥完作用后会被分解为氨基酸和多肽，被机体吸收，不会残留；其次饲料中添加的酶制剂属于外源性酶，在结构和组成上与动物自身分泌的内源性酶存在一定差别，因此不会对动物产生影响。目前，市场上饲用酶制剂品种很多，根据酶的作用可分为消化酶和非消化酶两大类。消化酶是动物本身就能够分泌到消化系统内的酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，在饲料中添加外源酶后可以协助动物自身分泌的消化酶一道将饲料中不易消化的大分子物质分解为易被吸收的小分子物质，起到增强消化功能的作用。非消化酶是动物自身不能分泌、需要从外界获得的酶，通过添加到饲料被动物采食后，这些酶能够分解一些动物自身不能消化的物质，降解一些抗营养因子，主要有纤维素酶、植酸酶、果胶酶等。根据酶的种类数量可分为单酶制剂和复合酶制剂。动物饲料中通常含有多种营养物质，而酶具有严格的专一性和特异性，因此单酶制剂的作用效果要低于复合酶制剂。复合酶制剂通过多种酶的协同作用，来降解饲料中的各种底物，可最大限度地提高饲料中能量、蛋白质和纤维素等营养物质的利用率，从而达到提高动物增重速度和饲料利用率的目的。饲用酶制剂作为绿色天然、安全有效的饲料添加剂，已经在水产、家禽、牲畜的养殖方面有了较为广泛的应用。在饲料中添加酶制剂，既可以提高畜禽生产性能，降低养殖成本，又可以拓宽饲料的原料范围，提高饲料的转化效率，还能降低畜禽排泄物中氮和磷的含量，改善饲养环境，在促进养殖业向资源节约型和环境友好型的方向发展中具有重要的作用。随着养殖业的发展以及人们对环境保护和食品安全的日益关注，饲用酶制剂的研发与应用日益受到重视，其在国内外市场上的需求一直保持高速增长的态势。微生物发酵是当前饲用酶制剂的主要生产方法，与过去的直接从动植物组织器官提取相比，这种方法产量高，成本低，工艺简单，并且生产出的酶在物理和化学性质上，与动物体内自然产生存在的酶基本一致。工业生产中应用较为广泛的产酶微生物主要包括霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌和部分的放线菌。霉菌中的木霉属、曲霉属不仅拥有强大的产酶能力，而且不产生真菌毒素，因此在发酵工业中被广泛应用。芽孢杆菌具有强大的产酶系统，能够利用多种营养物质，能分泌中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶等多种胞外酶，与植物源、动物源蛋白酶相比，芽孢杆菌蛋白酶具有良好的生物学性质，如催化效率高、作用条件温和、作用范围广、安全无毒副作用，目前在工业生产中也广泛应用。微生物发酵的模式主要有固态发酵和液态发酵。固态发酵是指待发酵的物质在没有游离水或含水量极低的情况下利用微生物的活动进行发酵的过程，是当前最常用的发酵模式，具有技术含量低、设备要求简单，成本投入少的特点。液态发酵是指待发酵的物质在以液体为介质的情况下利用微生物的活动进行发酵的过程，相比于固态发酵，液态发酵更适合于工业化的大规模生产。固定化细胞技术是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。利用固定化细胞技术生产酶制剂具有以下优点：①保持细胞生命活力，细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快；②有利于细胞和产物酶的分离，减少酶的活力损失，酶的稳定性更高；③可循环利用发酵，省去菌种扩培操作，节省培养时间，节约原料，提高生产能力，降低生产成本。在酶制剂的生产过程中，现有技术大多采用单一菌株发酵生产一种酶，两种以上的菌株混合发酵生产两种以上的酶制剂的方式比较少，因为不同的菌株之间容易产生拮抗，产酶机理不同，难以协同共生。然而在实际使用过程中，两种及两种以上的复合酶制剂的作用效果更好，因此通常的生产方法是先单独制备某一种酶，再将不同的酶进行复配制备成复合酶制剂。这种方法存在着生产工艺复杂、生产效率较低、生产成本高等缺陷，亟需技术改进。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法。本专利技术的技术方案是通过如下方式来实施的：一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3-5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×107个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24-30h，分别获得这两种菌的菌悬液；2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18-24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18-24h，分别获得这两种菌的菌悬液；S2固定化细胞制备称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl2溶液中，制成直径约2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；S3固定化细胞通电培养将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31-33℃、转速145-155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；S4发酵产酶培养将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31-33℃，转速控制在175-185rpm，通气量控制在1.2-1.4V/V/M，共培养4-6d；S5酶制剂分离纯化培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；S6循环利用将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养。步骤S2所述的混合菌悬液中，黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的体积比为2:3:3:2。步骤S3所述的液体培养基的配方为（按1L计）：玉米粉20-26g，干酪素11-15g，（NH4）2SO44.4-5.0g，玉米浆8-12ml，KH2PO42.0-2.4g，MgSO4·7H2O0.4-0.6g，NaCl0.9-1.3g，柠檬酸钙0.2-0.4g，谷胱甘肽12-15mg，维生素C6.5-7.5mg，CoCl2·6H2O0.33-0.37mg，pH值自然。步骤S3所述的间歇性施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3‑5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×107个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24‑30h，分别获得这两种菌的菌悬液；2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18‑24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18‑24h，分别获得这两种菌的菌悬液；S2固定化细胞制备称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl2溶液中，制成直径约 2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；S3固定化细胞通电培养将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31‑33℃、转速145‑155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；S4发酵产酶培养将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31‑33℃，转速控制在175‑185rpm，通气量控制在1.2‑1.4V/V/M，共培养4‑6d；S5酶制剂分离纯化培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；S6循环利用将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养。...

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1菌株活化及扩大培养1）黑曲霉和康氏木霉：取黑曲霉和康氏木霉的保藏菌株，分别接种于PDA培养基平板上，30℃培养3-5d，以长满孢子为准；将孢子用无菌生理盐水洗下，制备成浓度约为1×107个/ml的孢子悬液，将孢子悬液以5%的接种量接入PDB培养基中，在30℃、150rpm的旋转摇床上培养24-30h，分别获得这两种菌的菌悬液；2）枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌：取枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的保藏菌株，分别接种于LB固体培养基斜面上，35℃培养18-24h，取3环斜面菌种，接入LB液体培养基中，在35℃、180rpm的旋转上摇床培养18-24h，分别获得这两种菌的菌悬液；S2固定化细胞制备称取适量的海藻酸钠加入无菌水中，加热融化制成浓度为6%的海藻酸钠溶液，待冷却到30℃左右时，将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌的混合菌悬液，与海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用8号注射针头滴入0.05mol/L的CaCl2溶液中，制成直径约2mm的固定化细胞颗粒，洗涤后备用；S3固定化细胞通电培养将制备好的固定化细胞颗粒加到装有液体培养基的三角瓶中，在温度31-33℃、转速145-155rpm的条件下培养24h，在培养的同时间歇性施加直流电场，进行刺激处理；S4发酵产酶培养将产酶培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐容量的60%左右，灭菌后接入通电培养后的固定化细胞颗粒进行发酵产酶培养，培养期间温度控制在31-33℃，转速控制在175-185rpm，通气量控制在1.2-1.4V/V/M，共培养4-6d；S5酶制剂分离纯化培养结束后将发酵液过滤，分离出固定化细胞颗粒和滤液，滤液进行超滤膜浓缩得到浓缩酶液，向浓缩酶液中加入10%体积的稻壳粉作为载体，充分搅拌混匀，然后进行喷雾干燥制成饲用酶制剂产品；S6循环利用将分离出的固定化细胞颗粒洗净后回收，接种到新鲜产酶培养基中，按照步骤S4所述方法再次进行发酵产酶培养；当固定化细胞产酶能力衰减50%时，进行恢复培养。2.根据权利要求1所述的一种利用固定化细胞技术发酵生产饲用酶制剂的方法，其特征在于，步骤S2所述的混合菌悬液中，黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，孔繁玲，周天策，
申请(专利权)人：江苏牧之歌生态农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32