本发明专利技术公开了一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)ZJB16085及合成R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸的应用，保藏编号CCTCC NO:M 2018408。本发明专利技术从腐植土中分离出有效转化R‑2‑苯氧基丙酸合成R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸的杂色曲霉(Aspergillus versicolor)CCTCC NO:M 2018408，其在10g/L底物存在条件下，能合成4.5g/L的R‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸，转化率为45％。
【技术实现步骤摘要】
杂色曲霉ZJB16085及合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的应用
本专利技术涉及一种转化R-2苯氧基丙酸合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的微生物及其筛选方法，属于生物工程
，特别涉及一株转化R-2苯氧基丙酸合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的杂色曲霉。
技术介绍
R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸是苯氧羧酸类和芳氧苯氧丙酸类除草剂合成过程中的关键中间体，可用于合成恶唑禾草灵(大豆、水稻)、吡氟禾草灵(油菜、马铃薯)、炔草酯(谷物)等除草剂。随着苯氧羧酸类除草剂被越来越多的关注，它作为除草剂的优点也越来越多被认知。作为具有对映异构体的手性农药，相对于外消旋农药的低效性和环境高污染性，光学纯的苯氧羧酸类除草剂具有除草效率高、对农作物伤害和环境污染低等优点。苯氧羧酸类除草剂的合成都会用到手性的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸作为中间体，因此，开发R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸高效合成方法备受关注。ElangoV等(USPatent5008439A)曾报道以对羟基苯乙酮作为原料，和α-卤代丙酸酯反应，经氧化和水解得到2-(4-羟基苯氧基)丙酸的外消旋体，再进一步经过拆分得到高光学纯的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。申永存等(合成化学，2006，04:398-401)对该工艺路线进行了系统的改进，用对羟基苯乙酮与α-氯代丙酸酯进行反应，通过氧化、水解和拆分等反应，合成了光学纯的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。该方法虽然产物分离纯化较易，但是需要多步反应才能完成，导致产品的收率不高，同时反应原料和试剂也不适合大规模生产。翁建全等(浙江工业大学学报，2009，04：362-365)曾报道以L-乳酸为起始化合物，通过酯化、磺酰化和醚化等步骤，生成高光学纯的R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。其中S-2-(4-甲苯磺酰氧基)丙酸生成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的反应中构型发生了反转，其反应机理：在氢氧化钠条件下，首先对苯二酚生成酚钠，S-2-(4-甲苯磺酰氧基)丙酸乙酯变为钠盐，由于钠离子带正电，酚钠的氧带负电，从位阻小的一面攻击S-2-(4-甲苯磺酰氧基)丙酸钠中的手性碳，形成中间体后，构型发生反转，转变为R型。邬春雷等(广州化工，2015，08:92-93)曾报道以L-丙氨酸为起始化合物，由氯化、醚化和酸化等步骤，其中醚化反应时构型发生翻转，生成产物R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。L-丙氨酸和L-乳酸工艺路线比较简单，反应步骤较少，但是条件很难控制。因反应过程中有对苯二酚参与，碱性环境中对苯二酚容易氧化生成醌，所以在后期纯化处理时未完全反应的对苯二酚和对苯二酚的二取代物很难被除去，使得产物的纯度受到影响。因此，在合成过程中，需要严格控制反应条件和物料比，以防止的副反应产生。目前，国外关于生物法制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的研究报道很少，其中BASF公司Dingler等(PestManagementScience,2015,46(1):33-35)曾报道通过球孢白僵菌羟化底物R-2-苯氧基丙酸，合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。KinneM等(TetrahedronLetters,2008,49(41):5950-5953)曾报道利用茶树菇过氧化酶，在添加H2O2条件下将外消旋体的2-苯氧基丙酸选择性羟基化生成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。随着人们对环境保护的重视，原始的化工产业受到了一定的冲击，同时推动了绿色生物制造工业的迅速发展，因此生物法制备R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸有很大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂色曲霉(Aspergillusversicolor)ZJB16085及转化R-2苯氧基丙酸合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的方法。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一株杂色曲霉(Aspergillusversicolor)ZJB16085，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2018408，保藏日期2018年6月28日，保藏地址中国武汉武汉大学，邮编430072。本专利技术杂色曲霉CCTCCNO:M2018408从腐植土中经过两次富集培养，挑取可以在含有底物R-2-苯氧基丙酸的培养基中生长的菌株接入96孔板发酵初筛，采用4-氨基安替比林显色法筛选出可以将底物R-2-苯氧基丙酸转化成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的初筛菌株，然后再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛获得的。本专利技术还提供一种杂色曲霉ZJB16085在催化R-2苯氧基丙酸合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸中的应用，所述应用是以杂色曲霉ZJB16085经发酵培养获得的发酵液为催化剂和反应介质，加入底物R-2苯氧基丙酸，在温度25-30℃、摇床转速150-200rpm条件下进行转化反应，获得含R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的转化液，将转化液分离纯化，获得R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。所述底物在发酵液中的终浓度为10-50g/L，优选10g/L；所述发酵液中湿菌体含量为15～20g/L，优选20g/L。进一步，所述杂色曲霉ZJB16085经发酵培养获得的发酵液按如下方法制备：将杂色曲霉ZJB16085接种至发酵培养基中，在温度25-30℃、摇床转速150-200rpm条件下发酵培养(优选培养至发酵液中湿菌体含量15～20g/L)，获得发酵液；所述发酵培养基组成：葡萄糖5-20g/L、酵母提取物5-10g/L、硫酸铵5-10g/L、七水合硫酸镁0.5-1.0g/L、一水硫酸锰0.05-0.12g/L、磷酸二氢钾1.5-2.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6-6.0g/L、微量元素液1-5mL/L，溶剂为去离子水，用5M的氢氧化钠溶液调节pH值6.8，115℃灭菌20min；所述微量元素液组成：硫酸亚铁七水合物2g/L、硫酸锌(Ⅱ)四水合物100mg/L、硼酸300mg/L、氯化钴(Ⅱ)六水合物200mg/L、氯化铜(Ⅱ)二水合物10mg/L、氯化镍(Ⅱ)六水合物20mg/L、钼酸钠二水合物30mg/L，以去离子水作为溶剂。进一步，所述发酵培养基组成：葡萄糖5g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵5g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.05g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、三水合磷酸氢二钾3.6g/L、微量元素液1mL/L，溶剂为去离子水，用5M的氢氧化钠溶液调节pH值6.8，115℃灭菌20min。进一步，所述杂色曲霉ZJB16085在接种前先进行斜面活化和种子培养，再将种子液以体积浓度3-10％(优选3％)的接种量接种至发酵培养基，具体为：将杂色曲霉ZJB16085接种至斜面培养基，在28℃静置培养6-7d，获得斜面菌种；从斜面中挑取菌体接种至装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，28℃、150-200rpm培养2-3d，获得种子液；所述斜面培养基(PDA培养基)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH自然，115℃灭菌20min；所述种子培养基(PDA培养基)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH自然，115℃灭菌20min。本专利技术建立了一个快速有效的筛选生物法合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸微生物菌株的方法，即设计了一种以筛选可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.杂色曲霉(Aspergillus versicolor)ZJB16085，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2018408，保藏日期2018年6月28日，保藏地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.杂色曲霉(Aspergillusversicolor)ZJB16085，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2018408，保藏日期2018年6月28日，保藏地址中国武汉武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述杂色曲霉ZJB16085在催化R-2苯氧基丙酸合成R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是以杂色曲霉ZJB16085经发酵培养获得的发酵液为催化剂和反应介质，加入底物R-2苯氧基丙酸，在温度25-30℃、摇床转速150-200rpm条件下进行转化反应，获得含R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸的转化液，将转化液分离纯化，获得R-2-(4-羟基苯氧基)丙酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物在发酵液中的终浓度为10-50g/L；所述发酵液中湿菌体含量为15～20g/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述杂色曲霉ZJB16085经发酵培养获得的发酵液按如下方法制备：将杂色曲霉ZJB16085接种至发酵培养基中，在温度25-30℃、摇床转速150-200rpm条件下发酵培养，获得发酵液；所述发酵培养基组成：葡萄糖5-20g/L、酵母提取物5-10g/L、硫酸铵5-10g/L、七水合硫酸镁0.5-1.0g/L、一水硫酸锰0.05-0.12g/L、磷酸二氢钾...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，周海岩，胡海峰，姜瑞，王银龙，李一作，郑裕国，王远山，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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