纤维连接蛋白的生物学活性测定方法技术

本发明专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，该纤维连接蛋白的生物学活性测定方法为：将纤维连接蛋白包板，然后加入细胞附着，然后测定附着所述细胞的量，然后计算生物学活性。本发明专利技术采用细胞与蛋白之间的粘附作用对纤维连接蛋白(Fn)进行生物学活性检测，本公发明专利技术创建的检测方法能够准确，快速，便捷的检测出纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性，能够广泛应用于对纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性检测。本发明专利技术有还有以下特点：可操作性、便捷性和准确性。

【技术实现步骤摘要】
纤维连接蛋白的生物学活性测定方法
本专利技术属于生物制品领域，特别涉及纤维连接蛋白生物活性检测方法。
技术介绍
纤维连接蛋白(Fn)是一种大的模块化糖蛋白，在细胞外基质(ECM)中作为聚合物纤维网络发现，并且在血浆和其他体液中可作为可溶性二硫键连接的二聚体。蛋白质亚基由三种类型的同源结构重复组成，称为FnI型，II型和III型。纤连蛋白是纤维蛋白，肝素，硫酸软骨素，胶原/明胶和许多整联蛋白受体的配体。它涉及多种细胞过程，包括细胞粘附/迁移，血液凝固，形态发生，组织修复和细胞信号传导。纤连蛋白功能由ECM中的不溶性聚合物原纤维介导。ECM中非功能性可溶性纤连蛋白向纤连蛋白原纤维的转化受到严格调节。该过程由纤连蛋白与细胞表面整合素结合引发，导致构象变化和聚合所需的隐蔽表位暴露。现有针对纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性检测方法为检测纤维连接蛋白(Fn)与明胶的亲和能力，该方法结果误差大，并且不能直接体现该蛋白在生物体内的作用机制以及活性。
技术实现思路
为了解决上述现有各种方法的不足，本专利技术其中一方面开发了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法。针对纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性检测，本专利技术采用细胞与蛋白之间的粘附作用对纤维连接蛋白(Fn)进行生物学活性检测，本公专利技术创建的检测方法能够准确，快速，便捷的检测出纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性，能够广泛应用于对纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性检测。本专利技术有还有以下特点：可操作性：实验所需材料为Jurkat细胞，该细胞为实验室常用细胞，易于获得。便捷性：整个实验流程不超过20个小时，并且实验步骤简单，能够快速得到实验结果。准确性：实验所用细胞Jurkat为悬浮细胞，能够避免贴壁细胞贴壁对实验结果的干扰，并且实验能够得到较好的梯度，得到准确的生物学活性。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，该纤维连接蛋白的生物学活性测定方法为：将纤维连接蛋白包板，然后加入细胞附着，然后测定附着所述细胞的量，然后计算生物学活性。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，上述纤维连接蛋白的生物学活性测定方法步骤如下：将纤维连接蛋白包板的步骤如下：步骤1：用蛋白包被液稀释纤维连接蛋白样品，纤维连接蛋白起始稀释浓度为10μg/ml，起始浓度后三倍稀释9个梯度，向96孔板每孔加入100μl蛋白稀释液包板，每个浓度设置两个复孔；步骤2：弃去经步骤1包板后的96孔板中的液体，每孔加入200μlPBS清洗1次；所述加入细胞附着步骤如下：步骤3：经步骤2的所述96孔板每孔加入100μl细胞密度1.0×106个/ml的细胞，将含有细胞的96孔板孵育直到细胞与包板蛋白粘附；步骤4：弃去经步骤3的所述96孔板中的细胞培养液以及没有与蛋白粘附的细胞，加入PBS和CCK混合液，100μl/孔，然后将96孔板置于37℃反应3.5h；所述测定附着所述细胞的量的步骤如下：步骤5：使用酶标仪在450nm波长下测每孔的OD值；计算生物学活性的步骤如下：步骤6：通过每孔纤维连接蛋白样品浓度和每孔的OD值计算纤维连接蛋白的生物学活性。通过每孔纤维连接蛋白样品浓度和每孔的OD值，将数据输入到Origin8软件中进行非线性(曲线)拟合，分析得出纤维连接蛋白的生物学活性。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，上述PBS和CCK混合液中PBS:CCK(v/v)＝10:1。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，上述细胞为Jurkat细胞。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，上述步骤3加入的细胞经过细胞复苏和细胞传代，细胞复苏和细胞传代步骤如下：细胞复苏步骤：取冻存有Jurkat细胞的细胞冻存管，将所述细胞冻存管置于37℃水浴锅中，直到冻存管内的液体完全溶解，将冻存管内的液体与5ml含有10％FBS的1640培养基混合，850rpm离心5min，弃离心管内的上清，细胞沉淀用6ml含10％FBS的1640培养基重悬，重悬混匀后将细胞加入到细胞培养瓶中。细胞传代的步骤：每隔一天对经细胞复苏的Jurkat细胞进行计数传代，传代细胞密度为3×105个/ml，传代培养基为含有10％FBS的1640培养基。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，上述计算纤维连接蛋白的生物学活性的值为半数有效量基ED50的值。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，计算方法为：将样品浓度和得出的OD值输入到Origin8分析软件中做散点图，样品浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，横坐标类型为log10。根据散点图做非线性(曲线)拟合，分析得出纤维连接蛋白的生物学活性。根据本专利技术的一方面，本专利技术提供了一种纤维连接蛋白的生物学活性测定用试剂，其特征在于，所述试剂为PBS和CCK混合液，所述PBS和CCK的体积比为10:1。更为具体的试剂为PBS和CellCountingKit(CCK-8)混合液，PBS和CCK-8试剂的体积比为10:1。附图说明图1、为本专利技术其一个实施例中实验数据图。具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本专利技术的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本专利技术的其他实施例，都属于本专利技术的权利保护范围。下面将结合附图对本专利技术作进一步的说明。实施例1：纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性测定方法本专利技术根据细胞的黏附性原理，将待测样品包板，加入Jurkat细胞，用CCK-8法检测附着细胞的量，从而反映待测样品的活性。1.细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的Jurkat细胞，将细胞冻存管置于37℃水浴锅中，指导冻存管内的液体完全溶解。将冻存管内的液体与5ml含有10％FBS的1640培养基混合，850rpm离心5min。弃离心管内的上清，细胞沉淀用6ml汗10％FBS的1640培养基重悬，重悬混匀后将细胞加入到T25细胞培养瓶中。2.细胞传代：每隔一天对Jurkat细胞进行计数传代，传代细胞密度为3×105个/ml，传代培养基为含有10％FBS的1640培养基。3.稀释蛋白：用蛋白包被液稀释样品，蛋白起始稀释浓度为10μg/ml，起始浓度后三倍稀释9个梯度，向96孔板每孔加入100μl蛋白稀释液包板，每个浓度设置两个复孔，96孔板置于4℃过夜。2.弃去96孔板中的液体，每孔加入200μlPBS清洗1次。3.每孔加入100μl细胞密度1.0×106个/ml的Jurkat细胞，将含有细胞的96孔板置于37℃孵育2h直到细胞与包板蛋白粘附。4.配制PBS和CCK-8混合液，PBS:CCK-8(v/v)＝10:1进行配制。5.弃去96孔板中的细胞培养液以及没有与蛋白粘附的细胞，加入上一步配置的PBS和CCK-8混合液，100μl/孔，将96孔板置于37℃反应3.5h。6.酶标仪在450nm波长下测每孔的OD值。实施例2：纤维连接蛋白(Fn)的生物学活性测定结果分析酶标仪检测后，96孔板读数数值：通过作图分析软件Origin8对所得数值进行分析结果如图1：由图1中结果可以看出随着包板蛋白浓度的改变，粘附在包板蛋白上的Jurkat细胞数量也发生改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，其特征在于，所述纤维连接蛋白的生物学活性测定方法为：将纤维连接蛋白包板，然后加入细胞附着，然后测定附着所述细胞的量，然后计算生物学活性。

【技术特征摘要】
1.纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，其特征在于，所述纤维连接蛋白的生物学活性测定方法为：将纤维连接蛋白包板，然后加入细胞附着，然后测定附着所述细胞的量，然后计算生物学活性。2.根据权利要求1所述的纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，其特征在于，所述纤维连接蛋白的生物学活性测定方法步骤如下：所述将纤维连接蛋白包板的步骤如下：步骤1：用蛋白包被液稀释纤维连接蛋白样品，所述纤维连接蛋白起始稀释浓度为10μg/ml，起始浓度后三倍稀释9个梯度，向96孔板每孔加入100μl蛋白稀释液包板，每个浓度设置两个复孔；步骤2：弃去经步骤1包板后的96孔板中的液体，每孔加入200μlPBS清洗1次；所述加入细胞附着步骤如下：步骤3：经步骤2的所述96孔板每孔加入100μl细胞密度1.0×106个/ml的细胞，将含有细胞的96孔板孵育直到细胞与包板蛋白粘附；步骤4：弃去经步骤3的所述96孔板中的细胞培养液以及没有与蛋白粘附的细胞，加入PBS和CCK混合液，100μl/孔，然后将96孔板置于37℃反应3.5h；所述测定附着所述细胞的量的步骤如下：步骤5：使用酶标仪在450nm波长下测每孔的OD值；计算生物学活性的步骤如下：步骤6：通过每孔纤维连接蛋白样品浓度和每孔的OD值计算纤维连接蛋白的生物学活性。3.根据权利要求2所述的纤维连接蛋白的生物学活性测定方法，其特征在于，所述PBS和CCK混合液中PBS:CCK(v/v)＝10:1。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：由超，朱梦洁，王笃强，
申请(专利权)人：吴江近岸蛋白质科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32