一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法技术

技术编号:20721549 阅读:29 留言:0更新日期:2019-03-30 17:01
本发明专利技术公开了一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法,由如下组分组成:链霉亲和素磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合,既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长,检测结果较慢的弊端,大大缩短反应时间,同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体,因磁性微球立体的特性,大大增加免疫反应的接触表面积,从而大大缩短检测时间,30分钟内即可检出结果。

【技术实现步骤摘要】
一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒及其制备方法,具体涉及一种基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)呈球形颗粒,外有脂质外壳、囊膜和棘突结构,内有由核心蛋白和核酸组成的核衣壳。HCV基因组5’非编码区保守,在设计用于诊断HCV感染的PCR引物时,此区段为首选。另外非结构蛋白区(NS2、NS3、NS4、NS5)中NS3基因区编码螺旋酶和蛋白酶,NS3蛋白具有强免疫原性,可刺激机体产生抗体,在临床诊断上有重要价值。抗-HCV不是保护性抗体,是HCV感染标志。大多数HCV感染都在急性期及慢性感染早期症状隐匿,慢性化率为60%至85%,其中又以年长者、男性局多。目前丙肝病毒血清学检测方法有酶联免疫(ELISA)、胶体金法、化学发光(CLIA)、电化学发光(ECL)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等。ELISA作为半定量检测方法是现应用最广的检测方法,但其灵敏度、线性宽度范围均未达到较高水平,难以适应市场发展的需求。胶体金法与ELISA均有相同的缺点。而CLIA及ECL虽灵敏度高但均存在检测设备造价高昂,而相应的标记物研发门槛高,短时期内国内均会受制于人的缺点同样也限制了在国内的推广。时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)灵敏度能达到CLIA一致的水平,不仅检测设备造价较低,并且相关技术在国内已相当成熟。传统时间分辨检测,仍以空白酶标板的物理吸附为主,检测过程耗时较长。缩短反应时间,降低检测成本,提高检测灵敏度及线性范围,将具有不错的市场前景。
技术实现思路
基于此,本专利技术的目的在于克服现有技术及相关技术检测费用高昂的缺点,提供一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,及所述试剂盒的制备方法。为实现上述目的,本专利技术采取如下技术方案:一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,由如下组分组成:链霉亲和素(SA)磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、浓缩洗液(清洗液)和增强液、RFID卡。优选地,所述的与镧系元素结合的IgG1抗体标记物,其中的镧系元素与IgG1融合蛋白抗体是通过中间螯合剂结合,镧系元素包括但不限于铕(EU)、钐(Sm),螯合剂包括但不限于异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA、二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA。优选地,所述的生物素抗原是由HCV重组抗原(含NS3、CORE)与HCV生物素化抗原(含NS3、CORE)按一定稀释比例混合后制成。本专利技术还提供一种采用上述试剂盒检测抗-HCV的方法,所述方法包括如下步骤:(1)用分析缓冲液将IgG1抗体标记物稀释至工作液;(2)用纯化水将浓缩洗液稀释至工作液;(3)将稀释好的工作浓度的SA磁性微球混匀后加于反应杯内;(4)将待检样本或阴性对照品、阳性对照品加于上述反应杯内;(5)将生物素化抗原加入反应杯内,室温下孵育;(6)孵育后使用(2)中的清洗工作液反应杯加磁洗涤;(7)洗涤后,加入(1)中标记物工作液,室温下孵育;(8)孵育后使用(2)中的清洗工作液反应杯加磁洗涤;(9)洗涤后,加入增强液孵育;(10)孵育结束后,进行对应波长的荧光采集检测并分析。优选地,本专利技术为了更进一步减少人工操作步骤,配合公司自研自产的SmartTRF全系列免疫荧光检测设备,将本专利技术检测方法的相应参数、操作步骤均悉数拷贝至RFID卡中。实际操作过程中,只需要将RFID卡与上述免疫荧光检测设备适配即可全自动完成上述实验的操作步骤。RFID(RadioFrequencyIdentification)技术,又称无线射频识别,是一种通信技术,可通过无线电讯号识别特定目标并读写相关数据,而无需识别系统与特定目标之间建立机械或光学接触。本专利技术还提供一种检测丙型肝炎抗体试剂盒的制备方法,所述方法包括如下步骤:(1)清洗、缓冲置换SA磁珠后,稀释至工作浓度制成SA磁性微球;(2)滴配HCV重组抗原及HCV生物化抗原,两者按最佳滴配浓度混合制成试剂盒生物化抗原;(3)制备阴性对照品、阳性对照品;(4)制备铕标记的IgG1抗体标记物;(5)制备分析缓冲液、浓缩洗液和增强液;(6)将各组份分别分装至相应的存储容器中;(7)RFID卡复制拷贝;(8)喷码、贴标签;(9)组装成成品试剂盒。与现有技术相比,本专利技术有益效果在于:本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合,既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长,检测结果较慢的弊端,大大缩短反应时间,同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体,因磁性微球立体的特性,大大增加免疫反应的接触表面积,从而大大缩短检测时间,30分钟内即可检出结果。另外,由于磁性微球的流体特性,不再受限于传统酶标板的框架限制,在任意的反应杯及小试管内即可完成检测,同时也能减小检测仪器设备的体积及成本以满足二、三线城市的全自动化检测需求,亦能如酶标板、化学反光检测一样进行大通量检测,满足一线城市的全自动化检测需求。附图说明图1为采用本专利技术所述检测试剂盒用来储存链霉亲和素(SA)磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的俯视示意图。图2为采用本专利技术所述检测试剂盒用来储存链霉亲和素(SA)磁性微球、铕标记结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的立体结构标意图示意图。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明,更好地说明本专利技术的技术特点、技术方案。以下实施例并不对本专利技术造成任何限制。以下实施例中SA磁性微球来源于JSR公司;铕标记购于芬兰Wallac公司;丙型肝炎病毒抗体国家参考品由中国食品药品检定研究院提供;对照试剂盒为雅培丙肝病毒抗体检测试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)。实施例1一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,所述试剂盒包括:链霉亲和素(SA)磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、浓缩洗液和增强液、RFID卡。本专利技术还提供上述检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒的制备方法,所述方法包括如下步骤:(1)制备链霉亲和素(SA)磁性微球:将3μm的链霉亲和素(SA)磁性微球使用25mMPH7.0的Tris-HCL缓冲液在磁力架上反复清洗4次后高浓度保存待用;其他组分制备完成后,将高浓度链霉亲和素(SA)磁性微球按不同使用浓度进行滴配,最终磁性微球使用浓度为100μg/ml,加液量为50μL/孔。(2)制备铕标记的IgG1抗体标记物:将IgG1抗体置于截留分子量为10000超滤离心管中,10000rpm离心7~10min,弃去滤液。再加入0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液10000rpm离心7~10min反复2~3次,将离心管滤膜反转3000rpm离心6min,收集最后浓缩的200μL溶液。并将其与事先用碳酸盐缓冲液溶好的DTTA-EU3+混合,IgG1抗体与铕质量比为3:1,2~8℃振荡混匀48±2小时。标记溶液经0.05MPH7.8Tris-Hcl缓冲液平衡的Sephade本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,其特征在于由如下组分组成:链霉亲和素磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。

【技术特征摘要】
1.一种检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,其特征在于由如下组分组成:链霉亲和素磁性微球、阴性对照品、阳性对照品、与镧系元素结合的IgG1抗体标记物、生物素化抗原、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。2.如权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,其特征在于,所述的与镧系元素结合的IgG1抗体标记物,其中的镧系元素与IgG1融合蛋白抗体是通过中间螯合剂结合,镧系元素为铕或钐,螯合剂为异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA或二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA。3.如权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒抗体试剂盒,其特征在于,所述的生物素抗原是由HCV重组抗原与HCV生物素化抗原混合后制成。4.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员:李根平
申请(专利权)人:广州源起健康科技有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1