一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，通过在偶联于羧基胶乳表面的抗体两条重链间，增加一个氨基酸支架，来增加抗体两个Fab之间的空间距离，从而减小胶乳比浊过程中抗体与抗原结合的空间位阻，提高灵敏度；本发明专利技术对采用常规羧基胶乳偶联抗体后的试剂进行改进，放大工艺成熟，利于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法
本专利技术涉及体外诊断试剂
，更具体的说是涉及一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法。
技术介绍
胶乳免疫比浊试剂中，灵敏度高低，直观的表现为吸光度信号值变化率高低及其测试重复稳定性，可以间接的通过最低检测限LOD来表述，即LOD越低，灵敏度越高。目前，常规提高胶乳比浊检测试剂灵敏度的方法包括提高试剂中增敏剂含量、提高胶乳粒径、使用长空间臂胶乳、增大样本量以及使用更高亲和力抗体。虽然提高试剂中增敏剂含量简单易用，提高灵敏度效果明显；但增敏剂常选用聚乙二醇，吐温-20和曲拉通100系列等，聚乙二醇系列浓度过高引起非特异性沉淀，假阳性；吐温-20和曲拉通100系列浓度与灵敏度关系成钟型，低浓度时随浓度其增加，试剂灵敏度提高，过高浓度时，降低试剂灵敏度。提高胶乳粒径：大粒径胶乳能够有效增加吸光度信号值，成倍提高试剂灵敏度，但是会导致试剂空白过高，而且大粒径胶乳通常会降低试剂线性范围和抗原过剩能力，且大粒径胶乳生产工艺更难控制，试剂存储稳定性也是难题。使用长空间臂胶乳：空间位阻，以及偶联在胶乳表面抗体的自由度，影响抗原抗体结合的难易，从而影响试剂灵敏度；虽然商业化的长链羧基胶乳也供应较多，但偶联过程相对常规羧基胶乳容易凝聚，放大工艺较为困难。增大样本量：在试剂不变情况下，提高样本量能成倍提升试剂灵敏度，但是牺牲线性及抗原过剩范围，且增大基质效应和干扰物浓度，导致测定不准确。使用更高亲和力抗体：亲和力高，能够更快更牢固的结合抗原，从而提高吸光度信号变化率及其重复稳定性。但著名品牌商业化的抗体，均经过了长期亲和力改进，亲和力再提高困难。因此，如何能够独立于现有技术外，再提高胶乳比浊试剂的灵敏度是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，该方法既能够提高试剂质量：最低检测限LOD低且重复性好，还能降低试剂成本：使用更少的抗体即可达到相同灵敏度。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，具体步骤如下：(1)将双链单特异性抗体与羧基胶乳共价偶联，在封闭前的胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素终浓度达到10-20mM/L；37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，断裂抗体两条重链以及轻链和重链间的二硫键，获得胶乳试剂；(2)将中部酸性，两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于支架溶解液中；所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；所述氨基酸支架序列如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3-4个自由组合的酸性氨基酸；环肽中部较强的酸性极性，有利于避免氨基酸支架介入到轻链和重链间的二硫键形成，在氨基酸支架不严重过量时，其较少的介入到轻链与重链间二硫键。X过长，可能由于位阻问题，使其嵌入重链间的效率不高；还会引起抗体结构破坏，部分变性失活，灵敏度提升不够，不如3和4个氨基酸。X短，极性不强，导致大量氨基酸支架参与轻链与重链间二硫键桥接，而抗体重链Fab间氨基酸支架不足，并且X端距离扩展不够大，灵敏度提升不如3-4个氨基酸。(3)对步骤(1)获得的胶乳试剂去除50％背景缓冲液，即换液50％；加入步骤(2)所述溶解有氨基酸支架的溶液，使每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架并混匀；向前述混合有氨基酸支架胶乳试剂中滴加50mmol/L的过硫酸钾溶液，所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(1)中尿素量的35-50％；(4)将步骤(3)滴加了过硫酸钾溶液的胶乳试剂于37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；重新形成二硫键，在抗体两条重链间增加了空间支架，增大抗体两个Fab之间的空间距离；部分轻链与重链间也会加入支架，对灵敏度提升影响不大；(5)将步骤(4)孵育后的胶乳试剂进行封闭并换液清洗去除残留氨基酸支架、尿素和过硫酸钾，制得成品试剂R2。优选地，步骤(1)所述胶乳溶液中尿素终浓度为20mM/L。优选地，步骤(2)所述支架溶解液为100mM/LpH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液。优选地，步骤(2)所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.015mg氨基酸支架。优选地，步骤(2)所述酸性氨基酸为天冬氨酸D和/或谷氨酸E。优选地，步骤(2)所述X为DDD，EEE，DED，EDE，EDD，DDE，EED，DEE，DDDD，EDDD，DEDD，DDED，DDDE，EEDD，EEED，EEEE，DDEE，DEDE，DEEE，EDEE，EEDE，EDED，DEED或EDDE。优选地，步骤(3)所述换液方法为离心、透析、层析柱或超滤换液。小规模换液采用离心换液，大规模换液采用超滤和层析柱。优选地，步骤(3)所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(1)中尿素量的50％。优选地，步骤(3)所述50mmol/L过硫酸钾溶液为用200ml支架溶解液溶解2.7032g过硫酸钾得到。优选地，步骤(5)所述封闭并换液清洗的具体步骤如下：将步骤(4)孵育后的胶乳试剂，22000rpm离心15min，去上清，加入适量(依赖于不同项目成品所需要胶乳浓度，通常为1-4g/L的胶乳终浓度)封闭清洗液复溶，室温混匀2小时，制得成品试剂R2。优选地，所述封闭清洗液为100mM/LpH7.5的PBS缓冲液，含0.1％V/V吐温-20，1g/LBSA，0.05％v/V防腐剂PC300。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，通过在偶联于羧基胶乳表面的抗体两条重链间，增加一个氨基酸支架，来增加抗体两个Fab之间的空间距离，从而减小胶乳比浊过程中抗体与抗原结合的空间位阻，提高灵敏度；本专利技术对采用常规羧基胶乳偶联抗体后的试剂进行改进，放大工艺成熟，利于推广。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。配制200mM/L，300mM/L，400mM/L，500mM/L的尿素水溶液各100ml，室温备用。配制支架溶解液：100mM/LPH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液，室温备用。配制50mM/L过硫酸钾溶液：即使用支架稀释液200ml溶解2.7032g过硫酸钾，4℃存放备用。配制封闭清洗液：100mM/LpH7.5PBS缓冲液，含0.1％v/V吐温-20，1g/LBSA，0.05％v/V防腐剂PC300，室温备用。多克隆抗体反应缓冲液试剂1-Pab(R1-Pab)：100mM/LpH7.5PBS缓冲液，含0.5％v/V吐温-20，0.05％v/V防腐剂PC300，终浓度350mM/L氯化钠，终浓度10g/L聚乙二醇6000，终浓度2ml/LScantibody公司阻断剂HBR22，室温备用。单克隆抗体反应缓冲液试剂1-Mab(R1-Mab)：100mM/LpH7.5PBS缓冲液，含0.5％v/V吐温-20，0.05％v/V防腐剂PC300，终浓度150mM/L氯化钠，终浓度15g/L聚乙二醇6000，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将双链单特异性抗体与羧基胶乳共价偶联，在封闭前的胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素终浓度达到10‑20mM/L；37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，获得胶乳试剂；(2)将中部酸性，两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于支架溶解液中；所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010‑0.020mg氨基酸支架；所述氨基酸支架序列如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3‑4个自由组合的酸性氨基酸；

【技术特征摘要】
1.一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将双链单特异性抗体与羧基胶乳共价偶联，在封闭前的胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素终浓度达到10-20mM/L；37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育1小时，获得胶乳试剂；(2)将中部酸性，两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架，室温溶解于支架溶解液中；所述氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；所述氨基酸支架序列如式Ⅰ所示，K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3-4个自由组合的酸性氨基酸；(3)对步骤(1)获得的胶乳试剂去除50％背景缓冲液，即换液50％，加入步骤(2)所述溶解有氨基酸支架的溶液，使每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架并混匀；向前述混合有氨基酸支架的胶乳试剂中滴加50mmol/L的过硫酸钾溶液，所述过硫酸钾的摩尔量为步骤(1)中尿素量的35-50％；(4)将步骤(3)滴加了过硫酸钾溶液的胶乳试剂于37度恒温摇床，120rpm温和旋转混匀孵育30min；(5)将步骤(4)孵育后的胶乳试剂进行封闭并换液清洗去除残留氨基酸支架、尿素和过硫酸钾，制得成品试剂R2。2.根据权利要求1所述的一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，其特征在于，步骤(1)所述胶乳溶液中尿素终浓度为20mM/L。3.根据权利要求1所述的一种提高胶乳比浊试剂检测灵敏度的方法，其特征在于，步骤(2)所述支架溶解液为100mM/LpH7.5，含0.1％v/V吐温-20的PBS缓冲液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钊，王金凤，蒋欣，
申请(专利权)人：柏荣诊断产品上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31