本发明专利技术公开了一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，属于NGAL检测技术领域。该试剂盒包括试剂1和试剂2，试剂1为反应缓冲液，试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，试剂1与试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。本发明专利技术通过人白蛋白和人IgG的添加可避免尿液样本中不同浓度人白蛋白和人IgG对于NGAL检测结果的干扰，进而提高尿液中NGAL检测的准确性；此外，结合试剂2的增敏处理，可在提高准确性的同时保证检测的高灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒
本专利技术涉及NGAL检测
，更具体的说是涉及一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒。
技术介绍
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)是急性肾损伤AKI的最理想标志物之一；丹麦Bioporto公司发现并生产了Elisa和胶乳免疫比浊法的试剂对NGAL进行检测，目前世界上绝大部分的NGAL研究均以Bioporto公司的试剂为研究基础。Bioporto公司授权雅培Abott公司使用其原料开发了化学发光法的NGAL检测试剂，并在中国NMPA获得注册证。尿液中NGAL的测定因其无创性已成为目前NGAL测定的主要方式；目前国内存在大量的NGAL检测试剂盒以及相关专利称其可解决NGAL测定过程中灵敏度、线性范围、试剂稳定性、准确度等一系列问题，然而其均未能有效解决临床使用中最关键的问题-临床样本测定准确性，即临床样本检测结果与Bioporto一致性问题(相关性良好，绝对数值接近)。例如，CN201711132885.0中记载，以聚乙二醇六氨为封闭剂可改善胶乳免疫比浊法检测试剂的灵敏度、特异性以及抗体结合胶乳颗粒的稳定性，能够和BioportoElisa试剂达到相关系数(R2)0.9334的相关性，相较于其他国内试剂取得了很大进步。然而，此相关系数仍然偏低，通常相关系数要达到0.95以上才能称为相关性良好；并且，J&W试剂和Bioporto绝对数值还有40％左右的偏差。因此，目前临床急需成本合理，准确性高，即测定尿液NGAL临床样本时，能够和Bioporto或雅培NGAL试剂检测相关性良好，相关系数大于0.95，绝对数值接近(相对偏差15％以内)的试剂盒。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1为反应缓冲液，试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，试剂1与试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。在NGAL检测试剂中，添加人白蛋白和人IgG，可使尿液样本加入试剂反应体系后的人白蛋白和人IgG浓度位于对NGAL测定抑制程度不明显的浓度区域，进而显著改善尿液NGAL测定的准确性。优选地，试剂1与试剂2的混合物中，人白蛋白终浓度不低于10000/xmg/L，人IgG终浓度不低于2000/xmg/L；其中x为待检测样品在试剂1与试剂2的混合物中的稀释倍数。优选地，人白蛋白添加于试剂2中，人IgG添加于试剂1中。优选地，试剂1中除人IgG外，还包括：试剂1缓冲液，电解质，表面活性剂，防腐剂，促凝剂和阻断剂。优选地，试剂1中除人IgG外，还包括：pH6.8-7.5的100mMHepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38-116.88g/L，吐温-205-20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇60005-15g/L，ScantibodyHBR-26阻断剂或菲鹏生物E-015阻断剂2-2.5mL/L。优选地，试剂2中除人白蛋白外，还包括：试剂2缓冲液，胶乳颗粒，抗体，表面活性剂，防腐剂和封闭剂。优选地，试剂2中除人白蛋白外，还包括：pH7.6-8.2的50mMTaps-NaOH背景缓冲液，羧基胶乳3g/L，NGAL兔多克隆抗体5mL/L，吐温-206mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；NGAL兔多克隆抗体选用Dako公司货号为OA995、浓度为5mg/mL的NGAL兔多克隆抗体。优选地，试剂2的制备包括如下步骤：(1)将抗体与胶乳颗粒共价偶联，先不进行封闭，获得胶乳溶液；(2)向胶乳溶液中加入尿素，使胶乳溶液中尿素中浓度为10-20mM/L，37℃下120rpm恒温孵育1h，获得胶乳试剂；(3)将步骤(2)获得的胶乳试剂中50％背景溶液弃去，换为支架溶液；支架溶液为中部酸性、两端含半胱氨酸的环肽的氨基酸支架溶解于支架溶解液中制得；氨基酸支架结构如式I所示，式中K为赖氨酸，C为半胱氨酸，X为3-4个自由组合的酸性氨基酸；氨基酸支架的用量为：每mg抗体对应0.010-0.020mg氨基酸支架；(4)向步骤(3)获得的混合有氨基酸支架的胶乳试剂中滴加50mmol/L的过硫酸钾溶液，于37℃下120rpm恒温孵育30min；过硫酸钾的摩尔量为步骤(2)中尿素用量的35-50％；(5)对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液进行封闭清洗，制得试剂2。事物总是具有两面性，本专利技术添加人白蛋白和人IgG虽然能够有效解决尿液NGAL测定准确性问题，但也明显的缺陷，样本中高浓度的人白蛋白和人IgG会造成测定结果偏低，本质上是其抑制尿液NGAL测定灵敏度的所致；将人白蛋白和人IgG添加到试剂中，会造成试剂整体灵敏度损失超过40％。因此，还需要在此基础上对试剂进行增敏处理，以弥补试剂中添加人白蛋白和人IgG带来的灵敏度损失。在实际使用时，可使用上述增敏方法制备试剂2，也可采用其他利于提升试剂灵敏度的方法配合本专利技术使用，以获得较为理想的尿液NGAL检测试剂盒。优选地，支架溶解液为100mM/LpH7.5，含0.1％v/v吐温-20的PBS缓冲液；过硫酸钾溶液为使用支架溶解液对过硫酸钾溶解获得；封闭清洗液成分包括：pH7.6-8.2的50mMTaps-NaOH背景缓冲液，吐温-206mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/L；并且添加有人白蛋白。优选地，步骤(5)中，对步骤(4)孵育后的胶乳试剂离心，弃去所有上清，加入封闭清洗液复溶，使胶乳终浓度为1-4g/L，室温混匀2小时，制得试剂2。进一步优选地，每mg抗体对应0.015mg氨基酸支架。进一步优选地，酸性氨基酸为天冬氨酸D和/或谷氨酸E。进一步优选地，X为DDD，EEE，DED，EDE，EDD，DDE，EED，DEE，DDDD，EDDD，DEDD，DDED，DDDE，EEDD，EEED，EEEE，DDEE，DEDE，DEEE，EDEE，EEDE，EDED，DEED或EDDE。进一步优选地，步骤(3)换液方法为离心、透析、层析柱或超滤换液。由上述技术方案可知，本专利技术通过在NGAL检测试剂中添加人白蛋白和人IgG，可避免尿液样本中不同浓度人白蛋白和人IgG对于NGAL检测结果的干扰，进而提高尿液中NGAL检测的准确性；此外，结合试剂2的增敏处理，可在提高准确性的同时保证检测的高灵敏度。附图说明图1所示为J&W和Bioporto胶乳比浊试剂对尿液临床样本检测的相关性比对。图2所示为人白蛋白浓度与尿液NGAL测定偏低程度梯度试验结果。图3所示为人IgG浓度与尿液NGAL测定偏低程度梯度试验结果。图4所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为反应缓冲液，所述试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，其特征在于，/n所述试剂1与所述试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。/n
【技术特征摘要】
1.一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述试剂1为反应缓冲液，所述试剂2为NGAL抗体致敏胶乳溶液，其特征在于，
所述试剂1与所述试剂2的混合物中含有人白蛋白和人IgG。
2.根据权利要求1所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂1与所述试剂2的混合物中，人白蛋白终浓度不低于10000/xmg/L，人IgG终浓度不低于2000/xmg/L；其中x为待检测样品在所述试剂1与所述试剂2的混合物中的稀释倍数。
3.根据权利要求2所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述人白蛋白添加于所述试剂2中，所述人IgG添加于所述试剂1中。
4.根据权利要求3所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂1中除人IgG外，还包括：试剂1缓冲液，电解质，表面活性剂，防腐剂，促凝剂和阻断剂。
5.根据权利要求4所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂1中除人IgG外，还包括：pH6.8-7.5的100mMHepes-NaOH背景缓冲溶液，氯化钠23.38-116.88g/L，吐温-205-20mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，聚乙二醇60005-15g/L，ScantibodyHBR-26阻断剂或菲鹏生物E-015阻断剂2-2.5mL/L。
6.根据权利要求3所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂2中除人白蛋白外，还包括：试剂2缓冲液，胶乳颗粒，抗体，表面活性剂，防腐剂和封闭剂。
7.根据权利要求6所述的一种高准确性尿液中NGAL检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂2中除人白蛋白外，还包括：pH7.6-8.2的50mMTaps-NaOH背景缓冲液，羧基胶乳3g/L，NGAL兔多克隆抗体5mL/L，吐温-206mL/L，proclin-300防腐剂0.35mL/L，牛血清白蛋白1g/...
【专利技术属性】
技术研发人员：王钊，庞傅，
申请(专利权)人：柏荣诊断产品上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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