一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条制造技术

本发明专利技术涉及一种新型冠状病毒2019‑nCoV抗体谱检测试纸条，属于新型冠状病毒2019‑nCoV检测技术领域。本发明专利技术提供了该检测试纸条的制备方法，是将高纯度的、特异性的新型冠状病毒抗原直接在硝酸纤维素膜上进行划线，烘干、封闭、再烘干处理；最后将硝酸纤维素膜粘贴在PVC胶板上，再贴上印有流水号的标签纸，最后裁切成合适的大小，即得检测试纸条。本发明专利技术运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试纸条的制备工艺，缩短了制备时间，易于大批量生产。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条
本专利技术涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条，属于新型冠状病毒2019-nCoV检测

技术介绍
免疫印迹法(Westernblotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，用于组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。传统免疫印迹法分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向原理阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压和大电流，通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。传统免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。但是该方法操作繁琐、步骤多，生产工艺复杂，不易形成商品化的产品。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重的疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，世界卫生组织将这种病毒引起的疾病命名为2019年冠状病毒病(COVID-19)，致死性病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(spikeprotein)、包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)、膜蛋白(Membraneprotein)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)。棘突蛋白(spikeprotein)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基(subunit)，S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(receptorbindingdomain，RBD蛋白)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基元件。棘突蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。SARS-CoV-2(2019-nCoV)的棘突蛋白与人ACE2互作来感染人的呼吸道上皮细胞。核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。目前，检测新型冠状病毒的方法有两种：核酸检测和血清抗体检测。核酸检测是世界卫生组织推荐的检测方法，但是该检测方法对检测环境的要求极高，对操作的专业性极强，难以进行快速的大规模测试。此外，呼吸样本材料的异质性和样本采集位置的不同，例如咽喉拭子、唾液或气管内抽吸物，都会影响2019-nCoV病毒核酸检测的灵敏度。血清抗体检测主要利用免疫层析法，该方法操作简单，对设备要求低，甚至无需检测设备；检测时间短；对于检测环境要求不高，一般15分钟左右即可出结果。该方法的缺点是假阳性率高，由于个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体，以及药物和肿瘤细胞等，易造成试验的交叉反应，出现假阳性的结果。因此血清抗体检测仅用作对新冠病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测，不能单独作为诊断指标用于筛查。因此，急需一种对检测环境要求不高、适合大规模的人群筛查、能避免假阴性和假阳性问题、灵敏度和特异性高、可以用于病程监控和疫苗效果评价的新型冠状病毒检测试纸条。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条。本专利技术运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试纸条的制备工艺，缩短了制备时间，易于大批量生产。本专利技术提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试纸条，技术方案如下：一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，是以硝酸纤维素膜为固相载体，所述硝酸纤维素膜上划有3条或4条检测线(T线)和1条质控线(C线)；所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；所述检测试纸条包括印有流水号的标签纸和PVC胶板，所述硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次固定在PVC胶板上。进一步地，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG。进一步地，所述重组S1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步地，所述重组E蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，所述重组S1蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOVSpike蛋白的全长基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgGFC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。理论Mw:76.5kD。进一步地，所述重组RBD蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOVSpike蛋白的第319位Arg到541位Phe的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到小鼠IgGFC的表达载体pCMV6-c.mFC上，得到重组质粒；将重组质粒转染Hek293细胞分泌表达融合蛋白，并通过ProteinA进行亲和纯化而获取。理论Mw:52kD。进一步地，所述重组N蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV核衣壳蛋白完整的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到pET28A-N-His的表达载体上得到重组质粒；将重组质粒转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw:46.5kD。进一步地，所述重组E蛋白的制备方法为：通过合成编码新型冠状病毒2019-nCOV包膜蛋白完整的基因，并利用PCR的方法将合成的基因构建到HIS-C-pET28A-N-GST的表达载体上。测序正确的质粒制备后转大肠杆菌，表达重组蛋白，并通过镍柱进行亲和纯化而获取。理论Mw本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，以硝酸纤维素膜为固相载体，所述硝酸纤维素膜上划有3条或4条检测线和1条质控线；所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；所述检测试纸条还包括印有流水号的标签纸和PVC胶板，所述硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次固定在PVC胶板上。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，以硝酸纤维素膜为固相载体，所述硝酸纤维素膜上划有3条或4条检测线和1条质控线；所述检测线上固定有新型冠状病毒抗原；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；所述检测试纸条还包括印有流水号的标签纸和PVC胶板，所述硝酸纤维素膜和印有流水号的标签纸依次固定在PVC胶板上。


2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，所述质控线上固定有羊抗鼠IgG。


3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，所述重组S1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，所述重组RBD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，所述重组N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


6.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条，其特征在于，所述重组E蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


7.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玉章，吴长龙，
申请(专利权)人：无锡市孚维尔生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32