用于促进靶向基因编辑的组合物及其使用方法技术

公开了用于促进靶向基因编辑的组合物和方法以及其使用方法。在最优选的实施例中，基因编辑是利用基因编辑组合物如三链体形成寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶、TALENS等，组合基因修饰增效剂如干细胞因子(SCF)、CHK1或ATR抑制剂或其组合进行的。特别优选的基因编辑组合物是在γ位取代以增加DNA结合亲和力的三链体形成肽核酸(PNA)。还提供了用于细胞内递送该基因编辑组合物的纳米粒子组合物并且其特别适宜用于体内应用。

Compositions for Promoting Targeted Gene Editing and Their Use

Compositions and methods for promoting targeted gene editing and their use methods are disclosed. In the most preferred implementation, gene editing is performed using gene editing compositions such as triplex oligonucleotides, CRISPR, zinc finger nuclease, TALENS, etc., combined with gene modification synergists such as stem cell factor (SCF), CHK1 or ATR inhibitors or combinations thereof. A particularly preferred gene editing composition is a triplex-forming peptide nucleic acid (PNA) substituted at the gamma site to increase DNA binding affinity. A nanoparticle composition for intracellular delivery of the gene editing composition is also provided and is particularly suitable for in vivo applications.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于促进靶向基因编辑的组合物及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年2月16日提交的U.S.S.N.62/295,789的权益和优先权，该案以全文引用的方式并入。关于联邦政府资助的研究的声明本专利技术是根据美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)授予的AI112443以及美国国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的1012467在政府支持下完成。政府在本专利技术中享有一定权利。
本专利技术的领域大体上涉及基因编辑技术与基因修饰增效剂的组合使用，以及用于离体和体内基因编辑的组合物及其使用方法。
技术介绍
造血干细胞/祖细胞(HSPC)的基因编辑提供了用于治疗如镰状细胞贫血和β-地中海贫血之类遗传性病症的一种引人注目的策略。基因可以通过若干方法进行选择性编辑，包括靶向核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)(Haendel等人,《基因疗法(GeneTher.)》,11:28-37(2011))和CRISPR(Yin等人,《自然·生物技术(Nat.Biotechnol.)》,32:551-553(2014))、短片段同源重组(SFHR)(Goncz等人,《寡核苷酸(Oligonucleotides)》,16:213-224(2006))或三链体形成寡核苷酸(TFO)(Vasquez等人,《科学(Science)》,290:530-533(2000))。近期关注焦点集中在CRISPR/Cas9技术，因为该技术容易使用并且试剂设计便捷(Doudna等人,《科学》,3461258096(2014))。然而，与ZFN相同，CRISPR方法将活性核酸酶引入细胞中，可能会导致基因组的脱靶裂解(Cradick等人,《核酸研究(NucleicAcidsRes.)》,41:9584-9592(2013))，这一问题迄今为止尚未得到解决。一个替代方案是被设计用于位点特异性结合至基因组DNA的三链体形成肽核酸(PNA)寡聚物，该结合是通过链侵入并通过沃森-克里克(Watson-Crick)结合和胡斯坦结合(Hoogsteenbinding)与置换的DNA链形成PNA/DNA/PNA三链体实现(Egholm等人,《自然(Nature)》(伦敦(London)),365:566-568(1993)；Nielsen等人,《科学》(华盛顿特区(Washington,D.C.),1883-),254:1497-1500(1991)；Faruqi等人,《美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)》,95:1398-1403(1998))。PNA具有呈电中性的肽类主链以及能够以高亲和力与DNA和RNA杂交的核碱基。当共递送单链“供体DNA”作为含有所需序列修饰的模板时，PNA/DNA/PNA三链体募集细胞内源性DNA修复系统以起始基因组的位点特异性修饰(Rogers等人,《美国国家科学院院刊》,99:16695-16700(2002))。相信PNA诱导的基因组修饰部分地由核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair，NER)和同源依赖性修复(homology-dependentrepair，HDR)路径介导(罗格等人,《美国国家科学院院刊》,99:16695-16700(2002)；Chin等人,《分子致癌(MolecularCarcinogenesis)》,48:389-399(2009))。NER和HDR都是高保真度路径，并且PNA没有任何固有的核酸酶活性。这些特征一起可以解释利用PNA介导的基因编辑所见到的脱靶基因毒性的频率远低于基于核酸酶的方法的原因(McNeer等人,《基因疗法(GeneTherapy)》,20:658-669(2013)；Schleifman等人,《化学生物学(Chem.Biol.)》(美国马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA,U.S.)),18:1189-1198(2011)；Schleifman等人,《分子治疗学--核酸(Mol.Ther.--NucleicAcids)》,2:e135(2013))。具有延长的沃森-克里克结合结构域的尾-夹PNA(Tail-clampPNA，tcPNA)可以促进人类造血细胞以较高的效率和特异性进行基因编辑(Schleifman等人,《化学生物学》(美国马萨诸塞州剑桥),18:1189-1198(2011))并且在人类化小鼠模型中，聚合物纳米粒子(NP)可以将这些分子离体和体内有效地递送至人类HSPC中(McNeer等人,《基因疗法》,20:658-669(2013)；Bahal等人,《现代基因疗法(Curr.GeneTher.)》,14:331-342(2014))。尽管如此，仍需要用于改进的基因编辑的组合物和方法。本专利技术的一个目的是提供增进由基因编辑技术诱导或促进的基因修饰的增效剂。本专利技术的另一目的是提供具有增强的DNA结合的三链体形成分子。本专利技术的另一目的是提供基因修饰配制物，这些配制物实现治疗作用显著的靶位点修饰，并且具有减少的脱靶修饰。
技术实现思路
使用在γ位取代的三链体形成肽核酸(PNA)增加DNA结合亲和力以及刺激干细胞因子(SCF)/c-Kit路径实现了造血干细胞/祖细胞中极高水平的基因编辑。相信SCF/c-Kit路径可增强DNA修复基因表达和同源依赖性修复活性，有证据显示，刺激作用与DNA修复增加有关，确切地说，与HDR活性增加以及包括BRCA2和Rad51在内的HDR基因表达水平增加有关。在人类β-地中海贫血的小鼠模型中，注射SCF加含有γPNA和供体DNA的纳米粒子使疾病表型改善，具有临床上相关的β-珠蛋白基因校正频率(在骨髓中为4％)和极低的脱靶效应。小鼠显示贫血缓解以及血液血红蛋白含量持续升高至正常范围，网织红细胞计数减少和脾肿大恢复。公开了用于促进靶向基因编辑的组合物和方法以及其使用方法。在最优选实施例中，基因编辑是利用基因编辑组合物如三链体形成寡核苷酸、CRISPR、锌指核酸酶、TALENS等，结合基因修饰增效剂如SCF、CHK1或ATR抑制剂、DNA聚合酶α抑制剂、热休克蛋白90抑制剂(HSP90i)或其组合进行。特别优选的基因编辑组合物是在γ位取代以增加DNA结合亲和力的三链体形成肽核酸(PNA)。还提供了用于细胞内递送该基因编辑组合物的纳米粒子组合物并且其特别适宜用于体内应用。例如，一种修饰细胞基因组的示例性方法可以包括使细胞与有效量的以下各物接触：(i)基因编辑增效剂，该增效剂选自由以下组成的组：酪氨酸激酶C-kit配体、ATR-Chk1细胞周期检查点路径抑制剂、DNA聚合酶α抑制剂及热休克蛋白90抑制剂(HSP90i)；和(ii)可以诱导细胞基因组修饰的基因编辑技术，该技术选自由以下组成的组：三链体形成分子、假互补寡核苷酸、CRISPR系统、锌指核酸酶(ZFN)及转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)；其中基因组修饰在与(i)和(ii)两者接触的细胞群体中发生的频率高于在无(i)存在下与(ii)接触的等效群体中的频率。该方法还可以包括使细胞与供体寡核苷酸接触，该供体寡核苷酸包括例如通过基因编辑技术诱导或促进的供体插入或重组来校正或诱导细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三链体形成组合物，包含总体长度总计不超过50个核碱基的胡斯坦结合肽核酸(PNA)区段和沃森‑克里克结合PNA区段，其中所述两个区段能够与细胞的基因组中包含多嘌呤链段的靶区域结合或杂交以诱导链侵入、置换以及所述两个PNA区段和所述细胞的基因组的所述多嘌呤链段间三链分子的形成，其中所述胡斯坦结合区段通过胡斯坦结合而结合至靶双链体中至少五个核碱基长度，其中所述沃森‑克里克结合区段通过沃森‑克里克结合而结合至靶双链体中至少五个核碱基长度，并且其中所述PNA单体中的一个或多个是γPNA单体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.16 US 62/295,7891.一种三链体形成组合物，包含总体长度总计不超过50个核碱基的胡斯坦结合肽核酸(PNA)区段和沃森-克里克结合PNA区段，其中所述两个区段能够与细胞的基因组中包含多嘌呤链段的靶区域结合或杂交以诱导链侵入、置换以及所述两个PNA区段和所述细胞的基因组的所述多嘌呤链段间三链分子的形成，其中所述胡斯坦结合区段通过胡斯坦结合而结合至靶双链体中至少五个核碱基长度，其中所述沃森-克里克结合区段通过沃森-克里克结合而结合至靶双链体中至少五个核碱基长度，并且其中所述PNA单体中的一个或多个是γPNA单体。2.根据权利要求1所述的三链体形成组合物，其中所述胡斯坦结合区段包含一个或多个选自由假胞嘧啶、假异胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶组成的组的化学修饰的胞嘧啶。3.根据权利要求1或2所述的三链体形成组合物，其中所述沃森-克里克结合区段包含具有至多十五个核碱基的尾序列，所述尾序列通过沃森-克里克结合而结合至在所述三链体外的靶双链体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的三链体形成组合物，其中所述两个区段是通过连接子连接的。5.根据权利要求4所述的三链体形成组合物，其中所述连接子是在1个与10个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸单元之间。6.根据权利要求1至5中任一项所述的三链体形成组合物，其中所述区段能够与β-珠蛋白基因中包含以下序列的区域形成三链分子：GAAAGAAAGAGA(SEQIDNO:15)，或TGCCCTGAAAGAAAGAGA(SEQIDNO:16)，或GGAGAAA(SEQIDNO:17)，或AGAATGGTGCAAAGAGG(SEQIDNO:18)，或AAAAGGG(SEQIDNO:19)，或ACATGATTAGCAAAAGGG(SEQIDNO:20)。7.根据权利要求1至5中任一项所述的三链体形成组合物，其中(i)所述胡斯坦结合区段包含序列JTTTJTTTJTJT(SEQIDNO:30)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCTCTTTCTTTC(SEQIDNO:22)或TCTCTTTCTTTCAGGGCA(SEQIDNO:23)；(ii)所述胡斯坦结合区段包含序列TTTTJJJ(SEQIDNO:31)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CCCTTTT(SEQIDNO:25)或CCCTTTTGCTAATCATGT(SEQIDNO:26)；(iii)所述胡斯坦结合区段包含序列TTTJTJJ(SEQIDNO:32)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CCTCTTT(SEQIDNO:28)或CCTCTTTGCACCATTCT(SEQIDNO:29)；(iv)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTTTTJTTJ(SEQIDNO:36)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CTTCTTTTCT(SEQIDNO:37)；(v)所述胡斯坦结合区段包含序列TTJTTJTTTJ(SEQIDNO:38)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CTTTCTTCTT(SEQIDNO:39)；(vi)所述胡斯坦结合区段包含序列JJJTJJTTJT(SEQIDNO:40)并且所述沃森-克里克结合区段包含TCTTCCTCCC(SEQIDNO:41)；(vii)所述胡斯坦结合区段包含序列JJTJTTJ(SEQIDNO:56)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CTTCTCC(SEQIDNO:46)或CTTCTCCAAAGGAGT(SEQIDNO:47)或CTTCTCCACAGGAGTCAG(SEQIDNO:48)或CTTCTCCACAGGAGTCAGGTGC(SEQIDNO:205)；(viii)所述胡斯坦结合区段包含序列TTJJTJT(SEQIDNO:49)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCTCCTT(SEQIDNO:50)或TCTCCTTAAACCTGT(SEQIDNO:51)或TCTCCTTAAACCTGTCTT(SEQIDNO:212)；或(ix)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTJTTJT(SEQIDNO:52)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCTTCTCT(SEQIDNO:53)或TCTTCTCTGTCTCCAC(SEQIDNO:54)或TCTTCTCTGTCTCCACAT(SEQIDNO:55)；其中“J”是假异胞嘧啶。8.根据权利要求7所述的三链体形成组合物，其中所述区段被连接在一起并形成具有以下序列的分子：(i)lys-lys-lys-JTTTJTTTJTJT-OOO-TCTCTTTCTTTCAGGGCA-lys-lys-lys(SEQIDNO:33)；(ii)lys-lys-lys-TTTTJJJ-OOO-CCCTTTTGCTAATCATGT-lys-lys-lys(SEQIDNO:34)；(iii)lys-lys-lys-TTTJTJJ-OOO-CCTCTTTGCACCATTCT-lys-lys-lys(SEQIDNO:35)，(iv)lys-lys-lys-TJTTTTJTTJ-OOO-CTTCTTTTCT-lys-lys-lys(SEQIDNO:42)(IVS2-24)；(v)lys-lys-lys-TTJTTJTTTJ-OOO-CTTTCTTCTT-lys-lys-lys(SEQIDNO:43)(IVS2-512)；(vi)lys-lys-lys-JJJTJJTTJT-OOO-TCTTCCTCCC-lys-lys-lys(SEQIDNO:44)(IVS2-830)；(vii)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCAAAGGAGT-lys-lys-lys(SEQIDNO:160)；(viii)lys-lys-lys-TTJJTJT-OOO-TCTCCTTAAACCTGT-lys-lys-lys(SEQIDNO:57)；(ix)lys-lys-lys-TTJJTJT-OOO-TCTCCTTAAACCTGTCTT-lys-lys-lys(SEQIDNO:213)；(x)lys-lys-lys-TJTJTTJT-OOO-TCTTCTCTGTCTCCAC-lys-lys-lys(SEQIDNO:58)(tc816)；(xi)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:59)；(xii)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:59)(SCD-tcPNA1A)；(xiii)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:59)(SCD-tcPNA1B)；(xiv)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:59)(SCD-tcPNA1C)；(xv)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAGGTGC(SEQIDNO:209)(SCD-tcPNA1D)；(xvi)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAGGTGC-lys-lys-lys(SEQIDNO:209)(SCD-tcPNA1E)；(xvii)lys-lys-lys-JJTJTTJ-OOO-CTTCTCCACAGGAGTCAGGTGC-lys-lys-lys(SEQIDNO:209)(SCD-tcPNA1F)；(xviii)lys-lys-lys-TJTJTTJT-OOO-TCTTCTCTGTCTCCACAT-lys-lys-lys(SEQIDNO:60)；其中“J”是假异胞嘧啶并且O＝柔性8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、6-氨基己酸单体。9.根据权利要求1至5中任一项所述的三链体形成组合物，其中(i)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTJJTTT(SEQIDNO:91)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TTTCCTCT(SEQIDNO:83)或TTTCCTCTATGGGTAAG(SEQIDNO:84)；(ii)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTTJTJJ(SEQIDNO:91)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CCTCTTCT(SEQIDNO:86)或CCTCTTCTAGTTGGCAT(SEQIDNO:87)；(iii)所述胡斯坦结合区段包含序列TTJJJTTTJ(SEQIDNO:92)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CTTTCCCTT(SEQIDNO:89)或CTTTCCCTTGTATCTTTT(SEQIDNO:90)；(iv)所述胡斯坦结合区段包含序列JTTJJTJTTT(SEQIDNO:106)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TTTCTCCTTC(SEQIDNO:98)或TTTCTCCTTCAGTGTTCA(SEQIDNO:99)；(v)所述胡斯坦结合区段包含序列TTTTJJT(SEQIDNO:107)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCCTTTT(SEQIDNO:101)或TCCTTTTGCTCACCTGTGGT(SEQIDNO:102)；(vi)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTTTTTTJJ(SEQIDNO:108)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列CCTTTTTTCT(SEQIDNO:104)或CCTTTTTTCTGGCTAAGT(SEQIDNO:105)；(vii)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTTTTT(SEQIDNO:118)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TTTTTCT(SEQIDNO:111)或TTTTTCTGTAATTTTTAA(SEQIDNO:112)；(viii)所述胡斯坦结合区段包含序列TJTJTTTJT(SEQIDNO:119)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCTTTCTCT(SEQIDNO:114)或TCTTTCTCTGCAAACTT(SEQIDNO:115)；或(ix)所述胡斯坦结合区段包含序列TTTJTTT(SEQIDNO:120)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TTTCTTT(SEQIDNO:116)或TTTCTTTAAGAACGAGCA(SEQIDNO:117)；其中“J”是假异胞嘧啶。10.根据权利要求9所述的三链体形成组合物，其中所述区段被连接在一起并形成具有以下序列的分子：(i)lys-lys-lys-TJTJJTTT-OOO-TTTCCTCTATGGGTAAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:93)(hCFPNA2)；(ii)lys-lys-lys-TJTTJTJJ-OOO-CCTCTTCTAGTTGGCAT-lys-lys-lys(SEQIDNO:94)(hCFPNA1)；(iii)lys-lys-lys-TTJJJTTTJ-OOO-CTTTCCCTTGTATCTTTT-lys-lys-lys(SEQIDNO:95)(hCFPNA3)；(iv)lys-lys-lys-JTTJJTJTTT-OOO-TTTCTCCTTCAGTGTTCA-lys-lys-lys(SEQIDNO:155)(tcPNA-1236)；(v)lys-lys-lys-TTTTJJT-OOO-TCCTTTTGCTCACCTGTGGT-lys-lys-lys(SEQIDNO:156)(tcPNA-1314)；(vi)lys-lys-lys-TJTTTTTTJJ-OOO-CCTTTTTTCTGGCTAAGT-lys-lys-lys(SEQIDNO:157)(tcPNA-1329)；(vii)lys-lys-lys-TJTTTTT-OOO-TTTTTCTGTAATTTTTAA-lys-lys-lys(SEQIDNO:121)(tcPNA-302)；(viii)lys-lys-lys-TJTJTTTJT-OOO-TCTTTCTCTGCAAACTT-lys-lys-lys(SEQIDNO:122)(tcPNA-529)；(ix)lys-lys-lys-TTTJTTT-OOO-TTTCTTTAAGAACGAGCA-lys-lys-lys(SEQIDNO:123)(tcPNA-586)；或(x)lys-lys-lys-TJTJJTTT-OOO-TTTCCTCTATGGGTAAG-lys-lys-lys(SEQIDNO:93)；其中“J”是假异胞嘧啶并且O＝柔性8-氨基-3,6-二氧杂辛酸、6-氨基己酸单体。11.根据权利要求1至5中任一项所述的三链体形成组合物，其中(i)所述胡斯坦结合区段包含序列JTJTTJTTJT(SEQIDNO:132)并且所述沃森-克里克结合区段包含序列TCTTCTTCTC(SEQIDNO:126)或TCTTCTTCTCATTTC(SEQIDNO:127)；(ii)所述胡斯坦结合区段包含序...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·M·萨尔茨曼，P·格莱泽，R·巴哈尔，N·A·麦克内尔，D·H·兰利，E·基哈诺，
申请(专利权)人：耶鲁大学，卡内基梅隆大学，
类型：发明
国别省市：美国,US